線粒體呼吸鏈

ROS的產(chǎn)生的主要途徑來(lái)源于線粒體，在線粒體呼吸鏈中，尤其是在細(xì)胞高代謝狀態(tài)下，電子傳遞過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生泄漏，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊 

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成和折疊的關(guān)鍵場(chǎng)所。在抗體生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程需要氧化環(huán)境，如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）等酶類(lèi)催化反應(yīng)產(chǎn)生H?O?。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)折疊發(fā)生錯(cuò)誤時(shí)，會(huì)引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激。

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

細(xì)胞培養(yǎng)基中的成分（如維生素、氨基酸、葡萄糖等）在與氧氣和金屬離子相互作用時(shí)，或者發(fā)生環(huán)境光敏反應(yīng)時(shí)，也可能誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS。此外，高密度培養(yǎng)過(guò)程中的物理因素如攪拌速度、氣體流量等，也可能影響細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

電荷異質(zhì)性變化

ROS引起的蛋白質(zhì)氧化和脫酰胺化會(huì)改變抗體分子的電荷分布，從而增加酸性和堿性電荷異質(zhì)性。例如ROS攻擊重鏈CH2區(qū)的甲硫氨酸，形成蛋氨酸亞砜，使酸峰比例增加。再如ROS攻擊天冬酰胺（Asn）側(cè)鏈進(jìn)行脫酰胺化，導(dǎo)致酸峰增加。

聚集和片段化

ROS會(huì)增加蛋白質(zhì)的聚集和片段化程度。聚集體可能形成不溶性顆粒，影響抗體的純度和活性。片段化的抗體則可能失去其特異性和功能。例如，在雙特異性抗體的流加培養(yǎng)中，ROS水平升高會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞，引起二硫鍵錯(cuò)配，導(dǎo)致聚集體增加。

糖基化水平改變

ROS影響細(xì)胞內(nèi)糖基化過(guò)程，使N-糖基化甘露糖百分比降低，同時(shí)增加非還原性低分子量糖型比例。糖基化修飾的變化會(huì)對(duì)抗體的折疊、穩(wěn)定性和免疫原性產(chǎn)生影響。

顏色異常

光照（尤其藍(lán)光波段）誘發(fā)維生素B12光解導(dǎo)致粉紅色。再如ROS攻擊色氨酸使其氧化，色氨酸氧化產(chǎn)物（如犬尿氨酸）使抗體溶液變黃。

工藝參數(shù)控制

培養(yǎng)對(duì)數(shù)期前1-2天降溫至31°C-34°C，減緩細(xì)胞代謝速率，降低ROS的產(chǎn)生速率。維持穩(wěn)定溶氧（如40%-50%），避免高氧誘導(dǎo)ROS爆發(fā)，同時(shí)防止缺氧應(yīng)激。此外保持pH穩(wěn)定，避免酸堿波動(dòng)引起的代謝紊亂。

避光操作

用于抗體生產(chǎn)的培養(yǎng)基制備、運(yùn)輸儲(chǔ)存及生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，盡量采用物理避光措施，如用錫箔紙包裹或者用半透明罐體。在生產(chǎn)區(qū)域，安裝波長(zhǎng)>500 nm的安全燈，避免藍(lán)光誘導(dǎo)維生素B12轉(zhuǎn)化。

灌流培養(yǎng)

灌流培養(yǎng)通過(guò)持續(xù)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)、清除代謝廢物維持環(huán)境穩(wěn)態(tài)，并減輕線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以減少ROS生成；同時(shí)提升GSH/GSSG比率、減少重金屬積累（鐵、銅等過(guò)度積累催化Feton反應(yīng)產(chǎn)生ROS）來(lái)調(diào)節(jié)氧化還原平衡，從而降低氧化應(yīng)激。

優(yōu)化培養(yǎng)基成分

除了添加抗氧化劑外，還可以通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化來(lái)減少氧化應(yīng)激。例如，在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下優(yōu)化Fe2?濃度，或使用更穩(wěn)定的硒代半胱氨酸替代不穩(wěn)定的半胱氨酸。

添加抗氧化物質(zhì)

如在培養(yǎng)基中添加適量的氨基酸、維生素等抗氧化物質(zhì)，有助于增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的傷害。

相關(guān)閱讀：