在 96 孔 Gri3D 500 μm 孔徑的微孔塑料板中培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化胰腺癌類器官，并用抗癌藥物處理其 72 小時。利用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng) (Molecular Devices ) 的透射光 (TL) 對不同時間點類器官進(jìn)行連續(xù)拍攝，而后對類器官進(jìn)行活 / 死測定。通過 IN Carta 圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析 ( 圖 1 )。分析中，對每孔 40 個類器官進(jìn)行圖像分割，并從每個類器官中提取 50 多個指標(biāo)。最后，利用 StratoMineR 數(shù)據(jù)分析軟件 (Core Life Analytics)對每個類器官相關(guān)的特征進(jìn)行分析。

圖 1 類器官藥物處理工作流程示意圖。該工作流程結(jié)合了 Gri3D、高內(nèi)涵成像系統(tǒng)以及人工智能的圖像分析軟件 (Molecular Devices )

在 Palbociclib 暴露后，細(xì)胞死活的分析中顯示類器官的存活率隨著藥物濃度的增加而下降，而在 trametinib 處理的類器官中未觀察明顯現(xiàn)象 ( 圖 2B )。這種基于深度學(xué)習(xí)的 TL 圖像分析方法，可以有效地檢測到單個類器官隨時間變化的參數(shù)。此外，灰度非正態(tài)因子 (GLNN) 可作為類器官灰度值測試指標(biāo)。如圖 2C 所示，這個值隨著 Palbociclib 和 Trametinib 劑量的增加而降低 ( 見圖 2C )，這些藥物會引起類器官的生長缺陷。

圖 2 抗癌化合物暴露人胰腺癌 PDOs 72 小時結(jié)果。A. TL 圖像在曝光前 ( 0 小時 ) 和曝光后 ( 72 小時 ) 以及活 / 死 (Live/Dead) 實驗后的類器官的最大投影圖像。綠色：Calcein AM，活細(xì)胞；紅色：EthD-1，死細(xì)胞。B.Ethidium homodimer-1 (EthD-1) 與 Calcein AM 強(qiáng)度比。C. TL 圖像的灰度非正態(tài)因子(GLNN) 變化。誤差顯示標(biāo)準(zhǔn)差。每個點代表每個類器官。單因素方差分析 Dunnett 多重比較，**P<0,01，P****<0.0001，ns：不顯著。比例尺：250μm。

IN Carta 數(shù)據(jù)分析軟件提取了 TL、EthD-1 和 Calcein AM 通道中每個類器官相關(guān)的數(shù)百個特征參數(shù)。為了對藥物孔和對照孔進(jìn)行可視化和聚集分析，我們首先通過主要成分分析法將參數(shù)降維至三個組分，即 PCA01, PCA02 和 PCA03。然后，我們在 3D 散點圖中對藥物孔和對照孔進(jìn)行可視化，其中陰性對照和陽性對照分別形成其自己的簇 ( 圖 3 )，藥物中 50 uM Palbocilib 是唯一一個聚類更接近陽性對照的處理組 ( 圖 3 )，這個觀察結(jié)果與活 / 死細(xì)胞的結(jié)果分析一致 ( 圖 2 )。此外，從各藥物組 (Chebyshev 最大距離 ) 與平均陰性對照的排列中顯示，50 uM Palbociclib 排在首位，而四個陽性對照孔排名前六。從這些結(jié)果表明，50 uM Palbociclib 對人胰腺癌類器官的效應(yīng)最為明顯。

圖 3 通過主要成分分析進(jìn)行聚類和排序。A.、B.、C. 與原始功能有加權(quán)關(guān)聯(lián)的三個 PCA 組分。D. 三種 PCA 成分的 3D 散點圖。E. 藥物組、對照組與平均陰性對照的 Chebyshev 最大距離排序。

為了驗證我們的分析，我們使用統(tǒng)一流形逼近與投影法 (UMAP) 減少特征參數(shù)的維度情況。考慮到所有特征，聚類圖也顯示了聚類接近陽性對照的 50 uM Palbociclib 處理組。為確定我們是否能夠僅用明場圖像區(qū)分表型變化，我們僅使用 TL 通道的特征進(jìn)行分析，但是所得的 3D 散點圖顯示沒有明顯的聚類特征，這表明需要添加其他的特征進(jìn)行聚類。

圖 4 UMAP 降維和聚類。A. 所有特征的 UMAP 組份的 3D 散點圖。B. 僅 TL 通道特征的 UMAP 組份的 3D 散點圖。