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2025-01-10 10:52:26大粒徑流式分選系統(tǒng): 大粒徑流式分選系統(tǒng)是一種專(zhuān)門(mén)用于大粒徑生物樣本的流式分選設(shè)備。它采用先進(jìn)技術(shù)，具有分選精確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大粒徑生物樣本的高效、準(zhǔn)確分選。該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、藥物研發(fā)等領(lǐng)域，為科研人員提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具，有助于加速新藥研發(fā)進(jìn)程，推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)研究的深入發(fā)展。

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大粒徑流式分選系統(tǒng)問(wèn)答

2022-12-01 20:08:12流式高手來(lái)PK | 流式分選小技巧投票評(píng)選: 為期10天的流式分選小技巧征集已經(jīng)結(jié)束啦，大家對(duì)流式分選都有很多心得哦。經(jīng)過(guò)5位貝克曼應(yīng)用和市場(chǎng)專(zhuān)家的評(píng)選，有11位小伙伴的作品入圍本輪大眾投票。讓我們先來(lái)“康康”其中兩個(gè)吧~小技巧1：對(duì)于單克隆的孔板分選，可以適當(dāng)稀釋樣本。放慢進(jìn)樣流速。得到活率更好的單細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞團(tuán)塊：在樣本里加入適當(dāng)?shù)腅DTA和DNAase來(lái)防止。對(duì)于極脆弱的細(xì)胞分選：可以讓儀器運(yùn)行時(shí)的進(jìn)樣壓差控制在0.5以?xún)?nèi)。小技巧2：在細(xì)胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需用先用胰酶消化細(xì)胞，然后收集待測(cè)樣品細(xì)胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。還有很多非常實(shí)用的小技巧如果你也喜歡，就去掃碼為他點(diǎn)個(gè)贊吧！我們將根據(jù)點(diǎn)贊票數(shù)評(píng)選：一等獎(jiǎng)：Apple AirPods Por降噪耳機(jī)二等獎(jiǎng)：西部數(shù)據(jù)移動(dòng)硬盤(pán)三等獎(jiǎng)：機(jī)械鍵盤(pán)*其他入圍作品也可以獲得入圍獎(jiǎng)：超聲波眼鏡清洗機(jī)沒(méi)有入圍的小伙伴不要灰心，我們還有早鳥(niǎo)獎(jiǎng)放送哦~投票時(shí)間2022年12月1日-12月7日掃描上方二維碼快來(lái)你最心怡的3個(gè)小技巧點(diǎn)贊投票吧！*投票結(jié)束10個(gè)工作日會(huì)郵寄獎(jiǎng)品，請(qǐng)大家關(guān)注哦！

2022-11-22 20:20:26流式高手來(lái)PK | 流式分選小技巧有獎(jiǎng)?wù)骷?/a>: 你有沒(méi)有被這些問(wèn)題困惑：什么方法可以提高分選的細(xì)胞得率？分選樣本制備的時(shí)候怎樣避免團(tuán)塊？液流如何才能保持穩(wěn)定？……遇到這些問(wèn)題你又是怎樣用聰明的小腦袋解決的呢？比如當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)分選細(xì)胞死亡率高，可以通過(guò)調(diào)整collecting buffer改善。以293T細(xì)胞為例，collecting buffer中添加FBS或BSA可以顯著降低細(xì)胞死亡率至5%以下[1]。你有什么流式分選的小技巧呢？快來(lái)參與流式高手PK大賽，把你的分選小技巧分享給大家吧！還有驚喜好禮等著滿(mǎn)滿(mǎn)才氣的你哦~

2023-06-09 11:41:52 人人都是流式高手：Tumor-infiltrating lymphocytes(TILs) 分選秘籍: Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)識(shí)別和攻擊異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TILs的分選提供了一個(gè)重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治療相關(guān)性，推動(dòng)我們對(duì)腫瘤與免疫相互作用的理解。我們使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分選TILs主要應(yīng)用場(chǎng)景如下：01、鑒定和表征：流式細(xì)胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標(biāo)記物的特征來(lái)鑒定和表征不同的亞群。通過(guò)使用針對(duì)CD3、CD4、CD8和其他免疫細(xì)胞標(biāo)記物的特異性抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細(xì)胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。02、特定TIL亞群的純化：流式細(xì)胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過(guò)基于表面標(biāo)記物的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達(dá)譜。03、功能分析：分選后的TILs可用于功能性分析，以評(píng)估其免疫活性和功能。例如，可以測(cè)試分選后的TILs的增殖能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生、對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性或其他功能性實(shí)驗(yàn)。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見(jiàn)解。04、基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析：流式細(xì)胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細(xì)胞群，進(jìn)而進(jìn)行基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)分析分選TILs的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機(jī)制和信號(hào)通路。然而不同于外周血、脾臟中的淋巴細(xì)胞，TILs的流式檢測(cè)存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)方面，才能實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確、真實(shí)的多色復(fù)雜樣本流式檢測(cè)。圖1為外周血來(lái)源樣本淋巴細(xì)胞分型的流式檢測(cè)數(shù)據(jù)，由圖可見(jiàn)，淋巴細(xì)胞群體T、B細(xì)胞分群明顯，T細(xì)胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號(hào)干擾明顯，不過(guò)由于血液樣本碎片較少，與細(xì)胞分群明顯，故而對(duì)最終結(jié)果的影響并不大。圖1 血液樣本淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)然而，當(dāng)我們使用同樣的模板檢測(cè)腫瘤組織樣本時(shí)，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問(wèn)題。實(shí)體瘤組織細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細(xì)胞樣本的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，這些雜質(zhì)細(xì)胞及碎片會(huì)對(duì)流式檢測(cè)造成顯著的干擾。如圖2所示，T細(xì)胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽(yáng)性細(xì)胞，不符合已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。這些雙陽(yáng)性細(xì)胞主要是由于雜質(zhì)細(xì)胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對(duì)于流式檢測(cè)及流式分選的準(zhǔn)確性有很大影響，甚至?xí)?dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。圖2 浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以提高浸潤(rùn)腫瘤組織的淋巴細(xì)胞分選的準(zhǔn)確性呢？這里給大家以下幾點(diǎn)建議：01、增加Pan-Marker檢測(cè)：這里的Pan-Marker是指目標(biāo)細(xì)胞群均表達(dá)，但其他細(xì)胞群體及碎片不表達(dá)的表面標(biāo)記。CD45廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)的各個(gè)細(xì)胞亞群上，但在非免疫細(xì)胞上沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)很低。因此，在檢測(cè)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)CD45是否表達(dá)來(lái)區(qū)分免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞，以達(dá)到排除雜質(zhì)細(xì)胞干擾的目的。02、優(yōu)化樣本制備方案：對(duì)復(fù)雜樣本來(lái)講，樣本制備方案是否合適決定了流式實(shí)驗(yàn)的成功率。可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇最佳的消化酶配方和消化時(shí)間，在確保細(xì)胞得率的同時(shí)盡量減少雜質(zhì)干擾并最大限度的保存細(xì)胞活性及功能。此外，選擇合適的細(xì)胞分離手段進(jìn)行目的細(xì)胞的富集。例如，若針對(duì)淋巴細(xì)胞檢測(cè)，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個(gè)核細(xì)胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細(xì)胞的干擾。03、進(jìn)行Fc封閉：組織浸潤(rùn)的多種細(xì)胞，特別是單核/巨噬細(xì)胞以及DC細(xì)胞高表達(dá)抗體Fc端的受體。這些細(xì)胞在進(jìn)行流式抗體標(biāo)記時(shí)，即使不表達(dá)相關(guān)抗原，也可通過(guò)Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號(hào)。要解決這一問(wèn)題，可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化Fc封閉試劑，在標(biāo)記流式抗體前進(jìn)行Fc封閉即可。04、合理設(shè)定閾值：閾值的設(shè)定與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)即可。在流式分選實(shí)驗(yàn)中，若分選所得細(xì)胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號(hào)，僅保留少量碎片信號(hào)，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細(xì)胞用于qPCR、測(cè)序，特別是單細(xì)胞測(cè)序等基因組學(xué)應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細(xì)胞核碎片，在分選過(guò)程中就需要將盡可能多的碎片與目的細(xì)胞區(qū)分，因此應(yīng)當(dāng)設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號(hào)讓分選儀器檢測(cè)到，進(jìn)而有效確保分選所得目的細(xì)胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。05、利用空白熒光通道排除非特異：什么是空白熒光通道呢?舉一個(gè)例子，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)3色實(shí)驗(yàn)標(biāo)記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒(méi)有標(biāo)記APC，在檢測(cè)時(shí)APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽(yáng)性信號(hào)的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細(xì)胞有較強(qiáng)的非特異熒光信號(hào)，通常這些非特異的熒光信號(hào)在所有的流式熒光通道中均可檢測(cè)到?；谶@一原理，我們可在上樣時(shí)預(yù)留一到兩個(gè)空白熒光通道，樣本中的目的細(xì)胞沒(méi)有標(biāo)記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細(xì)胞的非特異信號(hào)在空白通道中通常也是陽(yáng)性的，我們就可以通過(guò)設(shè)門(mén)選擇空白通道中的陰性細(xì)胞來(lái)達(dá)到去除非特異信號(hào)的目的。需要注意的是，利用這一方法時(shí)要充分考慮補(bǔ)償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補(bǔ)償小或無(wú)補(bǔ)償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?6、增加細(xì)胞死活染料：死細(xì)胞的非特異性地結(jié)合會(huì)增加假陽(yáng)性。死細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號(hào)的檢測(cè)。在TILs分選中去除死細(xì)胞?？梢栽黾訑?shù)據(jù)準(zhǔn)確性：死亡的細(xì)胞可能會(huì)釋放細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)成分，這可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，引入假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。通過(guò)去除死細(xì)胞，可以提高分選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。并且為分選后TILs細(xì)胞活力提供保證：分選到活細(xì)胞可以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有效性和可靠性。死亡細(xì)胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細(xì)胞可以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从痴鎸?shí)的細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)。圖3 無(wú)死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較圖4 有死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細(xì)胞染色試劑盒（型號(hào) B10825）處理細(xì)胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進(jìn)行染色。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息顯示：兩個(gè)不同條件下，門(mén)內(nèi)細(xì)胞在上一門(mén)級(jí)百分比也不一樣，充分展示了消除死細(xì)胞以后的數(shù)據(jù)效果。

2023-07-03 11:42:58人人都是流式高手：GFP分選，這還有我不會(huì)的？: 很常見(jiàn)的場(chǎng)景如下：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測(cè)表達(dá)GFP細(xì)胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門(mén)方法讓GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比看起來(lái)有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門(mén)對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響。讓我們一個(gè)一個(gè)設(shè)門(mén)，把每種情況具體看一下。保持FITC通道上的門(mén)不變，我們來(lái)看一下在前向和側(cè)向的散點(diǎn)圖上設(shè)門(mén)在不同的位置，代表你選擇了什么類(lèi)型的細(xì)胞。只有P1賦予了藍(lán)色，其他門(mén)的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來(lái)細(xì)胞群在不同的圖上所處的位置。第一種設(shè)門(mén)，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門(mén)下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為61.36%。第二種設(shè)門(mén)，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)，這部分的細(xì)胞基本都是單個(gè)的，P2門(mén)下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.39%，較第一種高。第三種設(shè)門(mén)，密集細(xì)胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點(diǎn)圖可以看出來(lái)有單個(gè)細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門(mén)下 GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比為65.70%，較第一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點(diǎn)。這樣分析下來(lái)，大家最大的困惑是這三群細(xì)胞要不要圈，怎么圈才是最好的？讓我們?cè)诘?一張F(tuán)SC和SSC的散點(diǎn)圖上根據(jù)細(xì)胞群設(shè)三個(gè)門(mén)。三個(gè)門(mén)分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細(xì)胞群。P1顯示為單個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)ITC通道上陽(yáng)性細(xì)胞比例為65.54%。P4顯示大部分為粘連的細(xì)胞，因此在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為71.43%，較P1細(xì)胞群高，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞會(huì)增加GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會(huì)導(dǎo)致雖然篩選到陽(yáng)性細(xì)胞，但是單克隆源性降低。P5顯示為單個(gè)細(xì)胞，但是因?yàn)镕SC較P1小，考慮是細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽(yáng)性細(xì)胞比例為20.15%，較P1細(xì)胞群低的多，如果分析時(shí)加入這群細(xì)胞則會(huì)降低GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會(huì)呈現(xiàn)出陽(yáng)性，所以在分選中這群細(xì)胞不該圈選，或者在去除死細(xì)胞的門(mén)中去除。由此可見(jiàn)，如果只想要分析狀態(tài)好的單個(gè)細(xì)胞的GFP陽(yáng)性百分比，那你可以選擇P1門(mén)的設(shè)門(mén)方式，當(dāng)然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細(xì)胞對(duì)數(shù)據(jù)的干擾。練習(xí)題如果您在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測(cè)表達(dá)mCherry細(xì)胞的百分比時(shí)發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細(xì)胞群并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯分開(kāi)的兩群（由于細(xì)胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細(xì)胞百分比并且分選呢？