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細(xì)胞分選試劑盒問答

2022-03-01 10:17:17新品搶先試用 | 納米磁珠細(xì)胞分選，Get最方便的細(xì)胞分選方法！: 提到細(xì)胞分選實驗，大家首先想到就是流式細(xì)胞分選，該方法使用熒光抗體標(biāo)記單細(xì)胞懸液，再通過調(diào)節(jié)合適的電壓、補償?shù)?，可以將目的?xì)胞與非目的細(xì)胞區(qū)分開來。由于可以對多參數(shù)、不同熒光強度的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類、定量和分離，流式分選技術(shù)在同時進(jìn)行多標(biāo)記的細(xì)胞分選時，其地位無可替代。但是當(dāng)需要快速獲得某種分選后的細(xì)胞時，流式分選的操作較為復(fù)雜，且花費的時間過長，對細(xì)胞的刺激也比較大。因此，使用免疫納米磁珠進(jìn)行快速細(xì)胞分選的方法應(yīng)運而生，該方法不僅對細(xì)胞刺激性小、速度快，而且操作簡單，稍等片刻就可快速獲得目的細(xì)胞。（▲瑞沃德細(xì)胞分選新品）新品來襲，自主研發(fā)瑞沃德細(xì)胞分選產(chǎn)品包括自主研發(fā)的磁珠分選試劑盒和細(xì)胞分選柱，能在短時間內(nèi)通過簡單、快速的操作分選得到高純度、高活率的目標(biāo)細(xì)胞。使用流程同時，納米級別磁珠無需洗脫，分選得到的細(xì)胞可直接應(yīng)用于流式分析、細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞測序等下游實驗。結(jié)果展示純度*注：小鼠脾臟細(xì)胞樣本CD3分選后純度流式檢測結(jié)果，A為分選后陰性管（流出組分），B為分選后陽性管（滯留組分）。Marker激活情況注：小鼠脾臟細(xì)胞樣本CD3分選后激活Marker CD69檢測結(jié)果，A為分選后Day0檢測結(jié)果，B為分選后用CD3/CD28單抗激活Day3檢測結(jié)果應(yīng)用場景多，助力科學(xué)研究免疫學(xué)研究腫瘤學(xué)研究神經(jīng)生物學(xué)研究干細(xì)胞研究細(xì)胞治療四大特點，輕松獲取目標(biāo)細(xì)胞1、可獲得高純度，高活率，高得率的目的細(xì)胞2、獲得細(xì)胞可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)，測序等下游實驗3、溫和，低刺激，不改變細(xì)胞原本生物學(xué)特性4、高效便捷，操作簡單新品上市開啟免費試用活動小鼠CD3+/ CD4+/ CD8+三種細(xì)胞分選試劑盒按需任選，助您更好地細(xì)胞分選識別下方二維碼，快來申請免費試用

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2023-06-09 11:41:52人人都是流式高手：Tumor-infiltrating lymphocytes(TILs) 分選秘籍: Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) 是指浸潤腫瘤組織的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)識別和攻擊異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)對TILs的分選提供了一個重要的工具，用于表征、純化和研究浸潤腫瘤的免疫細(xì)胞群。它有助于研究人員了解TILs的組成、功能和潛在的治療相關(guān)性，推動我們對腫瘤與免疫相互作用的理解。我們使用流式細(xì)胞術(shù)來分選TILs主要應(yīng)用場景如下：01、鑒定和表征：流式細(xì)胞術(shù)允許我們根據(jù)TILs表面標(biāo)記物的特征來鑒定和表征不同的亞群。通過使用針對CD3、CD4、CD8和其他免疫細(xì)胞標(biāo)記物的特異性抗體來標(biāo)記細(xì)胞，我們可以區(qū)分和定量TILs中的各種T細(xì)胞亞群。這有助于我們了解腫瘤微環(huán)境中TILs的組成和多樣性。02、特定TIL亞群的純化：流式細(xì)胞術(shù)分選使我們能夠分離和純化感興趣的特定TIL亞群。通過基于表面標(biāo)記物的表達(dá)，對細(xì)胞進(jìn)行分選和篩選，我們可以收集純凈的TIL亞群用于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。這使研究人員能夠研究特定的TIL亞群，并研究其功能特性或基因表達(dá)譜。03、功能分析：分選后的TILs可用于功能性分析，以評估其免疫活性和功能。例如，可以測試分選后的TILs的增殖能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生、對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性或其他功能性實驗。這些分析提供了有關(guān)TIL亞群功能能力和潛在抗腫瘤免疫反應(yīng)的見解。04、基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析：流式細(xì)胞術(shù)分選可以獲得純凈的TIL細(xì)胞群，進(jìn)而進(jìn)行基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過分析分選TILs的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)譜，研究人員可以更深入地了解與TILs在腫瘤免疫中相關(guān)的分子機制和信號通路。然而不同于外周血、脾臟中的淋巴細(xì)胞，TILs的流式檢測存在更多的不確定性，需要有效優(yōu)化包括樣本處理、配色方案、上樣條件以及分析方法等實驗設(shè)計的各個方面，才能實現(xiàn)更為準(zhǔn)確、真實的多色復(fù)雜樣本流式檢測。圖1為外周血來源樣本淋巴細(xì)胞分型的流式檢測數(shù)據(jù)，由圖可見，淋巴細(xì)胞群體T、B細(xì)胞分群明顯，T細(xì)胞亞群也可清晰區(qū)分。另外，我們也可以看到，該數(shù)據(jù)以FSC通道設(shè)定閾值，其閾值設(shè)定值較低，導(dǎo)致碎片及噪音信號干擾明顯，不過由于血液樣本碎片較少，與細(xì)胞分群明顯，故而對最終結(jié)果的影響并不大。圖1 血液樣本淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)然而，當(dāng)我們使用同樣的模板檢測腫瘤組織樣本時，數(shù)據(jù)就出現(xiàn)了明顯問題。實體瘤組織細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，并且在將組織樣本制備成單細(xì)胞樣本的過程中會產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，這些雜質(zhì)細(xì)胞及碎片會對流式檢測造成顯著的干擾。如圖2所示，T細(xì)胞中出現(xiàn)了大量CD19和CD3雙陽性細(xì)胞，不符合已有文獻(xiàn)報道的結(jié)果。這些雙陽性細(xì)胞主要是由于雜質(zhì)細(xì)胞及碎片的非特異干擾導(dǎo)致的。這些干擾對于流式檢測及流式分選的準(zhǔn)確性有很大影響，甚至?xí)?dǎo)致得出錯誤的結(jié)論。圖2 浸潤腫瘤組織的淋巴細(xì)胞免疫分型流式數(shù)據(jù)那么，基于以上數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該如何優(yōu)化實驗設(shè)計以提高浸潤腫瘤組織的淋巴細(xì)胞分選的準(zhǔn)確性呢？這里給大家以下幾點建議：01、增加Pan-Marker檢測：這里的Pan-Marker是指目標(biāo)細(xì)胞群均表達(dá)，但其他細(xì)胞群體及碎片不表達(dá)的表面標(biāo)記。CD45廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)的各個細(xì)胞亞群上，但在非免疫細(xì)胞上沒有表達(dá)或表達(dá)很低。因此，在檢測淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞時，可通過檢測CD45是否表達(dá)來區(qū)分免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞，以達(dá)到排除雜質(zhì)細(xì)胞干擾的目的。02、優(yōu)化樣本制備方案：對復(fù)雜樣本來講，樣本制備方案是否合適決定了流式實驗的成功率?？筛鶕?jù)文獻(xiàn)報道并通過預(yù)實驗來選擇最佳的消化酶配方和消化時間，在確保細(xì)胞得率的同時盡量減少雜質(zhì)干擾并最大限度的保存細(xì)胞活性及功能。此外，選擇合適的細(xì)胞分離手段進(jìn)行目的細(xì)胞的富集。例如，若針對淋巴細(xì)胞檢測，利用Ficoll或Percoll密度梯度離心法富集單個核細(xì)胞，可有效去除脂肪、碎片及雜質(zhì)細(xì)胞的干擾。03、進(jìn)行Fc封閉：組織浸潤的多種細(xì)胞，特別是單核/巨噬細(xì)胞以及DC細(xì)胞高表達(dá)抗體Fc端的受體。這些細(xì)胞在進(jìn)行流式抗體標(biāo)記時，即使不表達(dá)相關(guān)抗原，也可通過Fc受體非特異性的結(jié)合流式抗體的Fc端，從而導(dǎo)致非特異信號。要解決這一問題，可購買商業(yè)化Fc封閉試劑，在標(biāo)記流式抗體前進(jìn)行Fc封閉即可。04、合理設(shè)定閾值：閾值的設(shè)定與實驗?zāi)康南⑾⑾嚓P(guān)。在流式分析實驗中，應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號即可。在流式分選實驗中，若分選所得細(xì)胞用于培養(yǎng)，同樣應(yīng)當(dāng)設(shè)定閾值去除絕大部分噪音及碎片信號，僅保留少量碎片信號，這樣做可以有效提高分選效率及回收率；但若分選所得細(xì)胞用于qPCR、測序，特別是單細(xì)胞測序等基因組學(xué)應(yīng)用，由于碎片中含有一定量的核酸片段乃至細(xì)胞核碎片，在分選過程中就需要將盡可能多的碎片與目的細(xì)胞區(qū)分，因此應(yīng)當(dāng)設(shè)定較低的閾值以暴露足量的碎片信號讓分選儀器檢測到，進(jìn)而有效確保分選所得目的細(xì)胞不摻雜核酸碎片，以免影響后續(xù)實驗準(zhǔn)確性。05、利用空白熒光通道排除非特異：什么是空白熒光通道呢?舉一個例子，我們設(shè)計一個3色實驗標(biāo)記FITC、PE、PE-Cy7三種染料，沒有標(biāo)記APC，在檢測時APC通道就是空白通道，是不應(yīng)該有陽性信號的。復(fù)雜樣本中的部分雜質(zhì)細(xì)胞有較強的非特異熒光信號，通常這些非特異的熒光信號在所有的流式熒光通道中均可檢測到?；谶@一原理，我們可在上樣時預(yù)留一到兩個空白熒光通道，樣本中的目的細(xì)胞沒有標(biāo)記這些空通道的熒光素，在這些通道里面是陰性的，而雜質(zhì)細(xì)胞的非特異信號在空白通道中通常也是陽性的，我們就可以通過設(shè)門選擇空白通道中的陰性細(xì)胞來達(dá)到去除非特異信號的目的。需要注意的是，利用這一方法時要充分考慮補償?shù)挠绊?，?好選擇與已用通道補償小或無補償?shù)耐ǖ雷鳛榭瞻淄ǖ馈?6、增加細(xì)胞死活染料：死細(xì)胞的非特異性地結(jié)合會增加假陽性。死細(xì)胞會產(chǎn)生自發(fā)熒光干擾特定信號的檢測。在TILs分選中去除死細(xì)胞。可以增加數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性：死亡的細(xì)胞可能會釋放細(xì)胞碎片和細(xì)胞內(nèi)成分，這可能會干擾實驗結(jié)果，引入假陽性或假陰性結(jié)果。通過去除死細(xì)胞，可以提高分選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。并且為分選后TILs細(xì)胞活力提供保證：分選到活細(xì)胞可以保證后續(xù)實驗的有效性和可靠性。死亡細(xì)胞不具備正常的生物活性和功能，因此分選到活細(xì)胞可以確保后續(xù)實驗?zāi)軌蚍从痴鎸嵉募?xì)胞生物學(xué)狀態(tài)。圖3 無死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較圖4 有死細(xì)胞排除處理的樣本分析比較復(fù)蘇后的PBMC在免疫染色之前不添加（圖 3）或者添加ViaKrome 405可固定活性染料（55℃，10分鐘）（圖 4）。然后，使用Perfix-nc細(xì)胞染色試劑盒（型號 B10825）處理細(xì)胞，并用Granzyme B-FITC、CD19-PE、CD14-ECD、CD79a-PC5.5、CD3-PC7 和 CD45- Krome Orange 進(jìn)行染色。數(shù)據(jù)統(tǒng)計信息顯示：兩個不同條件下，門內(nèi)細(xì)胞在上一門級百分比也不一樣，充分展示了消除死細(xì)胞以后的數(shù)據(jù)效果。

2023-07-03 11:42:58人人都是流式高手：GFP分選，這還有我不會的？: 很常見的場景如下：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，想用流式檢測表達(dá)GFP細(xì)胞的百分比并且分選，但是不同的設(shè)門方法讓GFP陽性細(xì)胞百分比看起來有差異，究竟下面哪種策略才適合呢？今天我們主要討論一下FSC和SSC上設(shè)門對GFP陽性細(xì)胞百分比的影響。讓我們一個一個設(shè)門，把每種情況具體看一下。保持FITC通道上的門不變，我們來看一下在前向和側(cè)向的散點圖上設(shè)門在不同的位置，代表你選擇了什么類型的細(xì)胞。只有P1賦予了藍(lán)色，其他門的顏色去掉，這樣，我們就可以很方便的看出來細(xì)胞群在不同的圖上所處的位置。第一種設(shè)門，除了左下角靠近0的碎片不圈，其他基本都圈上，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門下 GFP陽性細(xì)胞百分比為61.36%。第二種設(shè)門，只圈最密集的這一群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來，這部分的細(xì)胞基本都是單個的，P2門下 GFP陽性細(xì)胞百分比為65.39%，較第一種高。第三種設(shè)門，密集細(xì)胞群左邊的和左下角靠近0的碎片不圈，只圈右邊的這兩群，從第二張SSC-A和SSC-H排粘連的散點圖可以看出來有單個細(xì)胞也有粘連細(xì)胞，P2門下 GFP陽性細(xì)胞百分比為65.70%，較第一種高，和第二種差不多，但是稍微高一點。這樣分析下來，大家最大的困惑是這三群細(xì)胞要不要圈，怎么圈才是最好的？讓我們在第一張F(tuán)SC和SSC的散點圖上根據(jù)細(xì)胞群設(shè)三個門。三個門分別為P1、P4和P5，顯示了三種不同的細(xì)胞群。P1顯示為單個細(xì)胞，F(xiàn)ITC通道上陽性細(xì)胞比例為65.54%。P4顯示大部分為粘連的細(xì)胞，因此在FITC通道上的陽性細(xì)胞比例為71.43%，較P1細(xì)胞群高，如果分析時加入這群細(xì)胞會增加GFP陽性細(xì)胞百分比。如果在單克隆分選中選擇這群，會導(dǎo)致雖然篩選到陽性細(xì)胞，但是單克隆源性降低。P5顯示為單個細(xì)胞，但是因為FSC較P1小，考慮是細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮導(dǎo)致，所以其在FITC通道上的陽性細(xì)胞比例為20.15%，較P1細(xì)胞群低的多，如果分析時加入這群細(xì)胞則會降低GFP陽性細(xì)胞百分比。如果加入7AAD染料，這群會呈現(xiàn)出陽性，所以在分選中這群細(xì)胞不該圈選，或者在去除死細(xì)胞的門中去除。由此可見，如果只想要分析狀態(tài)好的單個細(xì)胞的GFP陽性百分比，那你可以選擇P1門的設(shè)門方式，當(dāng)然也可以把P1和P4都選上，再用SSC-A和SSC-H去掉粘連細(xì)胞對數(shù)據(jù)的干擾。練習(xí)題如果您在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，流式檢測表達(dá)mCherry細(xì)胞的百分比時發(fā)現(xiàn)，mCherry通道細(xì)胞群并沒有呈現(xiàn)明顯分開的兩群（由于細(xì)胞在mCherry通道有較高的自發(fā)熒光），要怎么確定mCherry細(xì)胞百分比并且分選呢？