植物細胞壁是保護植物細胞免受病原體入侵的第一道屏障，由纖維素、木質(zhì)素等在內(nèi)的多糖網(wǎng)絡組成。^{[1, 2]}而植物細胞壁中的多糖提供了大量潛在的可發(fā)酵糖，這些糖可能成為可再生生物燃料和化學品的來源。^[3]多糖作為膳食纖維的重要組成部分，已被證明對人類和動物的健康十分有益。^{[4, 5]}分析植物細胞壁多糖的含量、分布和它們之間的相互作用有助于帶來更多的洞察力，可進一步了解植物細胞壁的生物學功能及其潛在應用。
為了在微觀尺度上以非破壞性的方式揭示植物組織的組成，拉曼成像技術(shù)已成為一種重要的工具。拉曼成像是拉曼光譜技術(shù)的新發(fā)展，結(jié)合拉曼光譜檢測系統(tǒng)和光學顯微鏡，將簡單的單點分析拓展到對一定范圍內(nèi)樣品進行綜合分析，以圖像呈現(xiàn)樣品的化學組分空間分布及表面物理化學性質(zhì)等信息。^[6]在本應用中，愛丁堡儀器公司的RM5顯微拉曼光譜儀被用來分析植物細胞壁各組分的分布及含量。

材料與方法

使用配備532 nm激光和600 gr/mm光柵的RM5顯微拉曼光譜儀研究植物細胞壁各組分的分布及含量。由于植物樣品非常易損壞，因此必須小心使用拉曼光譜儀。RM5具有通過Ramacle^? 軟件控制的全自動激光衰減器，使用戶能夠確保樣品不會受到激光損壞。

圖1 愛丁堡儀器RM5顯微拉曼光譜儀

結(jié)果與討論

拉曼成像技術(shù)中每個像素都對應于拉曼光譜，這是一種“分子指紋”，通過對所提取的光譜進行分析，可以確定特定組分的存在，并顯示出它們在樣品中的位置和分布。RM5 采用的是真共焦技術(shù)的設計，內(nèi)置多檔連續(xù)可調(diào)的機械針孔，具備高共焦模式和高通量模式，為了降低背景噪聲的影響和提高成像的共焦度，實驗中選擇高共焦模式，共焦針孔選擇40μm，同時與機械狹縫聯(lián)用，實現(xiàn)zui大程度抑制背景干擾在生物和生命科學中，該技術(shù)用于組織、整個細胞或其部分的成像，而不需要染料染色。以植物細胞壁為例，其特征拉曼峰主要對應于細胞壁中纖維素與木質(zhì)素官能團。在圖2（C）和圖3（C）中可以看出，由于木質(zhì)素具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，光譜在1600 cm^-1 附近出現(xiàn)強烈振動峰; 典型的纖維素組分特征峰位于2889 cm^-1附近，來自—CH和—CH2的伸縮振動。^[7-9]若對光譜中1600 cm^-1和2889 cm^-1的特征峰進行成像，可分別獲得木質(zhì)素、纖維素組分含量分布圖。

圖2 植物細胞木質(zhì)素成像分布分析，A.白光圖；B.成像圖；C.光譜圖（成像區(qū)域70μm x 70μm, 步進為0.7μm）

圖3 植物細胞纖維素素成像分布分析，A.白光圖；B.成像圖；C.光譜圖（成像區(qū)域70μm x 70μm, 步進為0.7μm）

成像圖分析了70x70μm的植物細胞樣品，基于Ramacle軟件中的FastMap功能，在普通的CCD檢測器中可使樣品的單張光譜獲取時間縮短至3.7ms。圖2中（A）與（B）分別顯示了植物細胞的白光圖與木質(zhì)素在植物細胞壁中的拉曼成像圖，可更清楚的看到兩組分在其中的分布與含量。由圖2（B）中可看出，在3-4個細胞之間所存在的共有區(qū)域——細胞角隅處的拉曼信號zui強，表明在該區(qū)域的木質(zhì)素濃度Z高。而纖維素是在兩細胞之間的區(qū)域含量較高（圖3（B））。結(jié)合兩圖可知，植物細胞壁中木質(zhì)素的整體含量大于纖維素，而且兩者的分布相互獨立。該應用也證實了拉曼光譜成像技術(shù)在植物細胞壁化學組分研究方面的潛力。

結(jié)論

在本應用中，強調(diào)了拉曼成像技術(shù)可用于研究植物細胞壁內(nèi)木質(zhì)素、纖維素的分布和含量。RM5顯微拉曼光譜儀高的空間和光譜分辨率可進行高質(zhì)量的成像分析，RM5使用自動樣品臺進行拉曼譜圖的掃描，電動樣品臺能夠?qū)崿F(xiàn)X、Y和Z方向上精確移動控制，是植物細胞學非破壞研究的理想工具。

參考文獻

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