植物表型組學(xué)研究技術(shù)

——PlantScreen表型成像技術(shù)

一、 什么是表型組？什么是表型組學(xué)？

自 20 世紀(jì) 90 年代初以來，生命科學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了為引人注目的“組學(xué)”新概念和新學(xué)科，如基因組學(xué)（genomics）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）、蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）和代謝組學(xué)（metabolomics）等。伴隨各種組學(xué)的不斷興起和發(fā)展，90年代末，人們提出了表型組（phenome）和表型組學(xué)（phenomics）的概念（圖1）。

很多科學(xué)家都試圖為表型組和表型組學(xué)下一個為精確的定義。其中較為容易理解的表型組定義為：在細(xì)胞、組織、器官、生物體或種屬水平上表現(xiàn)出的所有表型的組合。表型組學(xué)可定義為一門在基因組水平上系統(tǒng)研究某一生物或細(xì)胞在各種不同環(huán)境條件下所有表型的學(xué)科[2]。

由此，我們可以知道，和其他生物學(xué)中的組學(xué)類似，表型組學(xué)是與基因組學(xué)對應(yīng)，研究基因組經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組而ZZ表現(xiàn)出來的各種表型的變化（圖2）。

圖2. 基因型與表型的關(guān)系[3]

在之前很長時間的研究中，國際上尤其是中國的科學(xué)家只關(guān)注基因組學(xué)。但僅僅研究基因組學(xué)肯定是不夠的。因為基因只有表達(dá)以后才能發(fā)揮其功能和作用。如果沒有對一個基因組所對應(yīng)的表型組進行研究，那么這個基因組的功能就只能說是一種推測、假說甚是臆測。因為沒有經(jīng)過精確的表型組實驗，一個特定的基因組如何發(fā)揮作用是完全不清楚的，也不能知道這個基因組能夠產(chǎn)生什么特殊的表型或者對不同環(huán)境條件有怎樣的適應(yīng)能力。這也是為什么從上世紀(jì)90年代末提出表型組和表型組學(xué)概念后，對它們的研究在國際上就逐漸變得炙手可熱的原因（圖3）。

因此，2013年Monya Baker在《Nature》發(fā)表文章“THE ‘OMES PUZZLE”將表型組學(xué)稱為“前景光明（Aspiring）”的組學(xué)研究項目（圖4）。

圖4. 目前的各種組學(xué)項目，表型組(phenome)被認(rèn)為是“前景極為光明的”[4]

二、 表型組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展

對于生物學(xué)家來說，表型從來都不是一個陌生的概念。從生物學(xué)尤其是植物學(xué)研究之初，科學(xué)家們就在不停地測量和描述植物的各種表型。但是從現(xiàn)代科學(xué)研究的角度來說，這種對于植物表型的研究一直處于較為簡單和粗放的階段。主要通過肉眼觀察和簡單測量獲得一些對植物外部物理性狀的描述，如株高、葉片數(shù)、開花數(shù)、分蘗數(shù)、葉面積、葉長等。多也就是通過簡單公式進行一定的量化，如葉面積指數(shù)、植物緊實度等。同時，因為人力、資金、環(huán)境條件等原因，一般只能在植物生長期的幾個階段進行有限的幾次測量，根本不能跟蹤整個生活史的詳細(xì)變化情況。

這種“經(jīng)典”的主要局限于對植物外部物理性的描述、基本未涉及內(nèi)部及生化的特征和性狀的植物表型研究，對于現(xiàn)代表型組學(xué)研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的（圖5）。

現(xiàn)代植物表型組學(xué)研究希望在全基因組測序的基礎(chǔ)上，對特定基因型海量表型參數(shù)進行高通量定量研究。而且這些表型參數(shù)并不單單是形態(tài)數(shù)據(jù)，還要包含了大量深層機理數(shù)據(jù)，使科學(xué)家能夠進一步通過對表型和基因型的對照研究鑒定并預(yù)測可遺傳的性狀。

為達(dá)到這一目的，需要的研究技術(shù)有：

w 植物彩色成像分析技術(shù)——形態(tài)學(xué)表型數(shù)據(jù)

w 植物葉綠素?zé)晒獬上穹治黾夹g(shù)——光合系統(tǒng)運作機理表型數(shù)據(jù)

w 植物高光譜成像分析技術(shù)——色素組成、生化成分、氮素含量、水分含量等表型數(shù)據(jù)

w 植物熱成像分析技術(shù)——表面溫度分布、氣孔導(dǎo)度與蒸騰等等表型數(shù)據(jù)

w 智能光照培養(yǎng)、澆灌與稱重技術(shù)——提供植物生長的環(huán)境并研究不同環(huán)境條件對植物表型的影響

w 自動化傳送和控制技術(shù)——綜合控制各個部件，對培養(yǎng)植物進行傳送，實現(xiàn)自動測量與整個生活史的連續(xù)培養(yǎng)

現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)為科學(xué)家達(dá)到這一目標(biāo)提供了支持。但是現(xiàn)在的挑戰(zhàn)是：1.如何將這些技術(shù)整合起來，建立用于不同植物物種的表型平臺；2.縮小實驗室與野外研究的差距[6]。

三、PlantScreen植物表型成像分析技術(shù)

PSI公司在2012年以FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)為核心，結(jié)合LED植物智能培養(yǎng)、自動化控制系統(tǒng)、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、自動條碼識別管理、RGB 真彩 3D 成像、自動稱重與澆灌系統(tǒng)等多項先進植物表型技術(shù)，開發(fā)出了PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)（圖6）。

圖6. PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)及其各個功能模塊

這一大型系統(tǒng)切合國際ZX的植物表型組學(xué)研究，以ZY化的方式實現(xiàn)了擬南芥、小麥、水稻、玉米乃各種其它植物的全方位生理生態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)高通量自動成像分析。用于高通量植物表型成像分析測量、植物脅迫響應(yīng)成像分析測量、植物生長分析測量、生態(tài)毒理學(xué)研究、性狀識別及植物生理生態(tài)分析研究等。

1. PSI公司的技術(shù)優(yōu)勢

由于表型組學(xué)研究的興起，現(xiàn)在有很多公司與科研機構(gòu)都在開發(fā)用于表型組學(xué)研究的儀器系統(tǒng)。但如果仔細(xì)探究這些公司的發(fā)展過程，好像他們在成立之初就能開發(fā)這么全面、高端的儀器系統(tǒng)。實際上這得益于歐美成熟的植物自動化培養(yǎng)技術(shù)。這一技術(shù)在歐美廣泛應(yīng)用于花卉、蔬菜等的生產(chǎn)（圖7）。這些公司大多是以植物自動化培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，再從別的廠家采購一些光源、相機組裝成所謂的表型研究儀器。這些廠家不但沒有真正的植物表型科研背景；各個成像模塊很多也是工業(yè)上使用的，并沒有大量科學(xué)文獻(xiàn)的支持，ZZ的數(shù)據(jù)精度根本無法滿足真正表型研究的需要；甚很多數(shù)據(jù)結(jié)果都沒有專用植物表型分析軟件，而只有簡單的圖像獲取功能。

而PSI公司則與這些廠家完全不同。

PSI公司是捷克科學(xué)院Nedbal教授與現(xiàn)任PSI公司總裁、布爾諾（孟德爾發(fā)現(xiàn)遺傳定律的城市）植物表型研究中心主任Trtilek博士共同成立的，是真正DJ植物科學(xué)家建立的公司，本身就承接大量歐盟的科研項目并與捷克科學(xué)院聯(lián)合成立了捷克變化中心（圖8）。

圖8. PSI公司總部及PSI植物表型研究中心，公司大門可見捷克變化中心和歐盟科研項目標(biāo)志

2015年是“遺傳學(xué)之父”孟德爾在捷克布爾諾發(fā)表其的豌豆雜交實驗《植物雜交試驗》論文150周年，PSI公司與歐洲工程技術(shù)中心（CEITEC）、捷克科學(xué)院CzechGlobe變化研究中心、Masarykova大學(xué)及孟德爾博物館共同舉辦了“國際植物與藻類表型組學(xué)會議”（International Plant and Algal Phenomics Meeting IPAP 2015，圖9），數(shù)十名歐美、亞洲的DJ植物科學(xué)家參加了本次會議。2016年9月還將舉辦IPAP 2016，詳情請點擊鏈接：IPAP2016。有興趣參加本次會議的老師可與易科泰生態(tài)實驗室聯(lián)系：王慧娟 info@eco-lab.cn；李川 eco-lab@eco-tech.com.cn

圖9. IPAP2015會議現(xiàn)場

PSI公司一直致力于開發(fā)各種植物表型相關(guān)研究技術(shù)，包括葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)、植物光譜技術(shù)、LED智能培養(yǎng)技術(shù)及各種藻類研究技術(shù)等。其開發(fā)的FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)已成為世界上權(quán)威、使用廣、種類全面、發(fā)表論文多的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)（圖10）。無論是葉綠素?zé)晒鈾?quán)威書籍《Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis》（Nedbal也是本書的合作作者之一），還是引用次數(shù)高達(dá)1200的葉綠素?zé)晒庋芯烤C述《Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In Vivo》都將FluorCam調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的出現(xiàn)作為葉綠素?zé)晒庋芯窟M入二維時代的里程碑[7, 8]。關(guān)于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的更多信息請查閱：如何選配適用的葉綠素?zé)晒獬上駜x器。

而他們生產(chǎn)的各種LED光源被很多其他歐洲公司和科研機構(gòu)直接用于集成生產(chǎn)各種植物生長箱和大型生長室（圖11）。PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)是將這些高精尖的科研儀器再輔以自動化控制部件集成的ZX儀器系統(tǒng)，并且制作了專用植物表型分析科學(xué)軟件，每一個成像模塊都可以在獲得幾十項表型相關(guān)參數(shù)和相應(yīng)的成像圖，保證了數(shù)據(jù)的精確性和可信度。PlantScreen是真正的科研級表型組學(xué)研究系統(tǒng)，受到國際科研機構(gòu)和大型跨國種業(yè)公司的一致認(rèn)可（圖12）。

同時，PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)由廠家專業(yè)工程師上門安裝。系統(tǒng)配備專用的網(wǎng)絡(luò)通訊軟件，后續(xù)使用中可通過網(wǎng)絡(luò)由廠家遠(yuǎn)程操作實現(xiàn)軟件更新和實時故障診斷，對客戶網(wǎng)絡(luò)沒有獨立IP等特殊要求。這一通訊軟件可以由用戶自行決定開啟和關(guān)閉并設(shè)置密碼，不必?fù)?dān)心數(shù)據(jù)通過網(wǎng)絡(luò)外泄。

圖12. 國內(nèi)外裝備PlantScreen的部分科研單位及跨國種業(yè)和農(nóng)藥公司

2. PlantScreen如何解決表型組學(xué)研究中的兩個挑戰(zhàn)

之前提到在表型組學(xué)研究中有兩個挑戰(zhàn)：1.如何將這些技術(shù)整合起來，建立用于不同植物物種的表型平臺；2.縮小實驗室與野外研究的差距。

對于DY個問題，PSI公司憑借自己的技術(shù)，根據(jù)客戶具體需求，對每一套系統(tǒng)都進行了特別定制，從而實現(xiàn)了對擬南芥、小麥、水稻、玉米乃各種其它植物的精確表型組學(xué)研究（圖13）。而一般的商用儀器，型號設(shè)計一旦定型就不能再做修改，往往不能適用于科學(xué)家的具體實驗要求。

圖13. 左：用于玉米、水稻、蔬菜的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)；右：捷克Palacky大學(xué)定制的用于擬南芥和豌豆的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)[10]

而縮小實驗室與野外研究差距的方法，就是直接在野外大田中開展表型組學(xué)研究。為此，PSI公司開發(fā)了野外樣帶版的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)，ZD限度實現(xiàn)了野外的表型組學(xué)成像自動分析（圖14）。同時，PSI正在開發(fā)可搭載到無人機上的小型表型成像分析平臺。

圖14. PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)野外樣帶版

四、 PlantScreen植物表型成像分析技術(shù)應(yīng)用案例

1. 葉綠素?zé)晒獬上穹治?/span>

葉綠素?zé)晒獬上窨梢詣討B(tài)反映植物連續(xù)生長過程中光合系統(tǒng)光合能力的變化。圖15中為鹽脅迫處理的擬南芥。對照組與處理組的量子產(chǎn)額ΦPSII從處理后就開始產(chǎn)生差異，這反映了鹽分對光系統(tǒng)II光下電子傳遞效率的影響。而從左側(cè)的成像圖中，我們可以通過顏色就直觀地分辨出兩者之間的差異。

圖15. 鹽脅迫下擬南芥的脅迫響應(yīng)研究

這種連續(xù)高通量熒光監(jiān)測，在一些快速脅迫表型分析中會更為有效。在給菜豆施加除草劑敵草隆后，我們可清晰地看到隨著敵草隆被葉片吸收擴散，首先是主葉脈基部的光合系統(tǒng)受到損傷，之后損傷逐漸擴展到主葉脈中部、次葉脈和葉肉（圖16）。

圖16. 敵草隆對菜豆葉片光合能力的損傷[11]

2. RGB 彩色 3D 成像分析

彩色成像主要用來分析植物的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)。圖17為干旱脅迫處理后擬南芥每天的形態(tài)學(xué)分析圖。我們可以明顯看到9-10天時，處理組的生長受到了極大的影響，葉片開始枯萎。

圖17. 干旱脅迫處理擬南芥的形態(tài)學(xué)分析圖

而通過專業(yè)軟件進行深入分析后，我們可以得到擬南芥的生長動態(tài)變化曲線、葉面積、植物緊密度、周長、葉片細(xì)長度（SOL）等二十余項形態(tài)學(xué)參數(shù)，將植物生長過程中的各種形態(tài)變化通過一系列量化的指標(biāo)體現(xiàn)出來（圖18）。

圖18. 干旱脅迫處理擬南芥的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)

同時，彩色成像可以進行不同方向的形態(tài)學(xué)分析，甚擬合3D形態(tài)學(xué)模型。帕拉茨基大學(xué)的Jan Humplík利用PlantScreen系統(tǒng)研究了兩種不同品種豌豆（Terno和Enduro）在低溫脅迫的表型變化[12]。他們使用RGB成像測量了7個時間點的總綠色面積、歸一化綠色面積和生長速率的變化（圖19），發(fā)現(xiàn)TER的生長速度要顯著高于END。到第21天，TER的總綠色面積增加了3.5倍，而END只增長了2.5倍。

圖19.TER植株在21天低溫適應(yīng)中的正面RGB成像圖[12]

3. 熱成像分析

PlantScreen的熱成像模塊主要用于獲得植物表面溫度分布的熱成像圖。用于各種植物溫度變化的研究，如干旱、高溫、滲透壓、熱干風(fēng)、病害等生物和非生物脅迫以及某些特殊發(fā)育階段造成的植物表面溫度分布變化，進而可以反映植物葉片蒸騰情況和氣孔導(dǎo)度的差異變化（圖20）。

通過在培養(yǎng)液中添加甘露醇模擬滲透壓脅迫，處理后的擬南芥因為無法進行正常的蒸騰作用，葉片溫度快速升高。生長過程中，對照組的溫度一直保持在22-23℃，而處理組的溫度竟然比對照組高了將近2℃（圖21）。

圖21. 滲透壓脅迫處理擬南芥的熱成像圖

4. 高光譜成像分析

PlantScreen的高光譜成像模塊主要用于測量植物的反射光譜成像圖，在測量的波段范圍內(nèi)可獲得幾十到上百張不同波段的光譜成像圖。這些成像圖用來計算如下植被指數(shù)：

1) 歸一化差值植被指數(shù)（Normalized Difference Vegetation Index (NDVI)）

2) 簡單比值指數(shù)（Simple Ratio Index, Equation: SR = RNIR / RRED）

3) 改進的葉綠素吸收反射指數(shù)（Modified Chlorophyll Absorption in Reflectance Index (MCARI1), Equation: MCARI1 = 1.2 * [2.5 * (R790- R670) - 1.3 * (R790- R550)]）

4) ZY化土壤調(diào)整植被指數(shù)（Optimized Soil-Adjusted Vegetation Index (OSAVI), Equation: OSAVI = (1 + 0.16) * (R790- R670) / (R790- R670 + 0.16)）