重組人血清白蛋白干擾素α2b融合蛋白（rIFNα2b-HSA），是由人干擾素α2b和人血清白蛋白2種編碼基因通過基因工程技術(shù)構(gòu)建的畢赤酵母工程菌，通過誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的胞外分泌蛋白。干擾素類重組蛋白藥品是目前臨床上廣泛用于治 療乙型肝炎、丙型肝炎等頑癥的有效藥物。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)重組蛋白制品的純度要求為不低于95.0%。

本次分享的應(yīng)用中，作者采用離子交換色譜柱TSKgel Q-STAT建立了測(cè)定重組人血清白蛋白干擾素α2b融合蛋白藥物純度的方法，經(jīng)驗(yàn)證該方法適合rIFNα2b-HSA純度檢測(cè)。

溶液配制

供試品溶液：采用水稀釋供試品成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。

專屬性驗(yàn)證樣品溶液：取供試品0.5 mL，加入0.8 mol/L氫氧化鈉溶液30 μL，置于搖床上，200 r/min搖動(dòng)10min，用5%磷酸溶液中和，用水稀釋2倍，按上述方法進(jìn)樣。

分析條件

色譜柱：TSKgel Q-STAT（4.6 mmI.D.×10 cm）

流動(dòng)相A：20 mM Tris-HCl (pH 8.5)

流動(dòng)相B：20 mM Tris-HC+0.5 M NaCl (pH 8.5)

梯度洗脫：0～3 min, 100%A; 3～18 min, 100%A-0%A; 18～21 min, 0%A; 21～22 min, 0%A-100%A

流速：0.5 mL/min

進(jìn)樣體積：20 μL

柱溫：25℃

檢測(cè)器參數(shù)：UV@214 nm&280 nm

分析結(jié)果

圖1 離子交換色譜法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

（藍(lán)色為214 nm；棕色為280 nm）

圖2 例子交換色譜法專屬性試驗(yàn)結(jié)果

（藍(lán)色為214 nm；棕色為280 nm）

圖3  濃度與峰面積線性關(guān)系圖

表1 三種純度測(cè)定方法檢測(cè)結(jié)果的比較（%）

結(jié)果與討論

采用TSKgel Q-STAT色譜柱建立的重組人血清白蛋白干擾素α2b融合蛋白純度測(cè)定方法 (見圖1)，主成分峰在 214 nm 處響應(yīng)值較280 nm 處更好，故采用 214 nm 作為該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。供試品經(jīng)堿破壞后，其降解產(chǎn)物色譜峰與主成分峰能有效分離 (見圖2)，表明方法專屬性良好。

線性考察結(jié)果見圖3，在濃度范圍0.05~1.0 mg/mL范圍內(nèi)，樣品濃度與峰面積，線性關(guān)系良好 (R2=0.9974)；精密度測(cè)試結(jié)果，RSD為0.52% (n=6)；定量檢測(cè)限為0.0018 mg/mL (S/N=10)；與反相色譜法、電泳法的對(duì)比檢測(cè)結(jié)果見表1，純度結(jié)果均大于95%。

以上結(jié)果均符合 2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證要求 ，可以作為重組人血清白蛋白與干擾素α2b融合蛋白的純度檢測(cè)方法之一。

參考資料：

1. 杜瑩瑩, 武福軍, 韓浩, 張亞男, 劉志向敏 離子交換色譜法測(cè)定重組人血清白蛋白干擾素α2b融合蛋白純度. 藥物分析雜志. 2020,40(8)：1490-1493