應(yīng)用痛點(diǎn)

維生素 K1（葉綠醌）在配方奶粉等復(fù)雜基質(zhì)中往往同時以兩種異構(gòu)體存在：VK1a（全反式）與 VK1b（順式）。二者結(jié)構(gòu)高度相似，常規(guī)反相柱容易出現(xiàn)峰形拖尾、分離不足或靈敏度受限，導(dǎo)致異構(gòu)體含量與穩(wěn)定性評估缺乏“可用的分離度”。

解決方案

本方法核心在于選用 Agilent ValueLab GP-C30 色譜柱：利用 C30 長碳鏈固定相帶來的更強(qiáng)形狀選擇性與更高柱效，顯著拉開 VK1a 與 VK1b 的保留差異；同時聯(lián)用鋅粉柱并采用熒光檢測，兼顧選擇性與靈敏度。

色譜柱性能亮點(diǎn)

在 ValueLab GP-C30（4.6 × 250 mm，3 μm）上可實(shí)現(xiàn) VK1a 與 VK1b 基線分離，分離度> 1.7；與 5 μm C30 相比，3 μm 粒徑柱效更高、分離更充分（分離度> 1.5）。方法在 10–400 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好（R2 > 0.999），檢出限低至 0.57 ng/mL（VK1a）與 0.60 ng/mL（VK1b），為奶粉中痕量異構(gòu)體定量提供了足夠的“分得開、測得準(zhǔn)”的基礎(chǔ)。

實(shí)驗部分

儀器和材料

實(shí)驗使用 Agilent 1260 Infinity II 高效液相色譜系統(tǒng)

色譜條件與參數(shù)

色譜柱：Agilent ValueLab GP-C30，4.6 × 250 mm，3 μm（PN：580973-630）

鋅粉柱：4.6 × 50 mm

流動相：甲醇 1000 mL + 冰醋酸 0.3 mL + 氯化鋅 1.5 g + 無水醋酸鈉 0.5 g

流速：1.0 mL/min

柱溫：30 °C

進(jìn)樣體積：10 μL

檢測：熒光檢測（Ex：243 nm，Em：430 nm）

結(jié)果與討論

色譜分離與分離度

在 Agilent ValueLab GP-C30 色譜柱（4.6 × 250 mm，3 μm）聯(lián)用鋅粉柱條件下，采用含氯化鋅的甲醇流動相，在 1.0 mL/min、30 °C 條件下實(shí)現(xiàn)了 VK1a 與 VK1b 的基線分離。VK1a 與 VK1b 的保留時間分別約為 22.0 min 和 23.1 min，分離度大于 1.7（圖 1）。本文進(jìn)一步考察了色譜柱粒徑對分離度的影響。與 5 μm C30 色譜柱相比，3 μm 色譜柱在分離 VK1 異構(gòu)體時表現(xiàn)出更高的分離度（分離度 > 1.5），而 5 μm 色譜柱的分離度則低于 1.5。

圖 1. VK1 異構(gòu)體在 Agilent ValueLab GP-C30 色譜柱（4.6 × 250 mm，3 μm）上的分離譜圖。

校準(zhǔn)線性與靈敏度

通過繪制峰面積與濃度的關(guān)系建立 VK1a 與 VK1b 的校準(zhǔn)曲線。在 10–400 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好（R2 > 0.999，圖 2）。線性回歸方程通過強(qiáng)制通過原點(diǎn)的方式建立：VK1a:y = 0.7013x（R2 = 0.99959）；VK1b:y = 0.7007x （R2 = 0.9994）。由于缺乏 VK1a 與 VK1b 的單體標(biāo)準(zhǔn)品，定量分析基于 VK1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并假設(shè)兩種異構(gòu)體具有相同的熒光響應(yīng)因子。對 10ng/mL 的標(biāo)品進(jìn)行測定，根據(jù)軟件讀得信噪比數(shù)值，按照 3 倍信噪比計算兩者的檢出限分別為：VK1a 為 0.57ng/mL；VK1b 為 0.60ng/mL（圖 3）。

圖 2. VK1a 與 VK1b 在 10–400 ng/mL 范圍內(nèi)的校準(zhǔn)曲線（R2 > 0.999）。

圖 3. 在 10ng/mL 濃度時的 VK1 的色譜圖和信噪比。

方法精密度與重現(xiàn)性

通過對 200 ng/mL VK1 標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣 6 次，對方法的重復(fù)性進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，VK1a 與 VK1b 的保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 0.055% 和 0.072%，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 1.230% 和 1.262%。上述數(shù)據(jù)表明，該方法具有優(yōu)良的精密度。

在食品樣品中的應(yīng)用

樣品分析

在優(yōu)化實(shí)驗條件下，對六種不同嬰幼兒配方奶粉樣品進(jìn)行了分析。樣品的制備過程依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn) B5009.158—2016^[1] 第一法中有關(guān)嬰幼兒食品、乳品及植物油處理方法進(jìn)行。各樣品中 VK1a 含量在 174–284 ng/g 之間，VK1b 含量在 17–45 ng/g 之間。采用所建立的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。六種嬰兒配方奶粉樣品分析圖如圖 4 所示，具體含量結(jié)果見表 1。

圖 4. 六種嬰幼兒配方奶粉的色譜圖。

表 1. 六種嬰幼兒配方奶粉種的 VK1 異構(gòu)體的含量

結(jié)論

本研究建立了一種基于 Agilent ValueLab GP-C30 色譜柱（聯(lián)用鋅粉柱、熒光檢測）的 VK1 異構(gòu)體分析方法。得益于 C30 固定相的形狀選擇性與 3 μm 粒徑帶來的高柱效，VK1a 與 VK1b 實(shí)現(xiàn)基線分離并可精確定量；方法線性范圍 10–400 ng/mL，檢出限分別低至 0.57 ng/mL 和 0.60 ng/mL。同時，流動相中氯化鋅的加入進(jìn)一步提升分離與響應(yīng)。穩(wěn)定性研究顯示 VK1a 隨儲存發(fā)生降解并部分轉(zhuǎn)化為 VK1b，提示需嚴(yán)格控制樣品處理與儲存條件。整體而言，該方法為食品基質(zhì)中痕量 VK1 異構(gòu)體檢測提供了穩(wěn)健、可復(fù)制的色譜解決方案。

參考文獻(xiàn)

食品中維生素 K1 的測定，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) GB5009.158—2016。

標(biāo)簽：安捷倫