單克隆抗體的表征對(duì)于產(chǎn)品的安全性和有效性至關(guān)重要。確定純度和表征二聚體或片段等雜質(zhì)是兩個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量參數(shù)。尺寸排阻色譜（SEC）與質(zhì)譜（MS）聯(lián)合使用在測(cè)定mAb精確分子量方面的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。然而，即使在高分子量m/z范圍內(nèi)執(zhí)行操作，傳統(tǒng)SEC一般都會(huì)產(chǎn)生大量的顆粒脫落，導(dǎo)致電離效率隨時(shí)間推移逐漸降低。為避免MS和MALS檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生顆粒脫落，東曹開發(fā)了一款U/HPLC尺寸排阻色譜柱TSKgel UP-SW3000-LS。

本應(yīng)用中，我們使用了TSKgel UP-SW3000-LS色譜柱對(duì)mAb標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了SEC-MS分析。數(shù)據(jù)表明，就MS觀察到的顆粒脫落情況，TSKgel UP-SW3000-LS色譜柱優(yōu)于其他品牌的UHPLC-SEC色譜柱。此外，與50次以上的初始進(jìn)樣相比，此款色譜柱有助于將電噴霧電離（ESI）源的電離效率保持在90%以上。

01
顯著降低SEC-MS檢測(cè)的顆粒脫落
根據(jù)我們的S次觀察結(jié)果，顆粒脫落不會(huì)只在特定的保留時(shí)間下發(fā)生。該現(xiàn)象會(huì)在整個(gè)洗脫過(guò)程種連續(xù)發(fā)生。因此，我們決定收集3到15分鐘洗脫時(shí)間內(nèi)的累積數(shù)據(jù)，以此量化單次SEC運(yùn)行期間色譜柱的脫落量（圖1）。

圖1  LC-MS測(cè)量SEC顆粒脫落的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

我們計(jì)算了每根色譜柱中不同分子離子的測(cè)量強(qiáng)度，量化了多次運(yùn)行SEC時(shí)色譜柱的顆粒脫落。分析序列包括10次平衡運(yùn)行（不進(jìn)樣）和10次普通運(yùn)行（色譜柱中注入了流動(dòng)相空白）。顆粒脫落的量化結(jié)果如圖2所示，其中橫軸為運(yùn)行次數(shù)，縱軸為顆粒脫落的強(qiáng)度或每秒計(jì)數(shù)量（cps）。

圖2  LC-MS量化SEC顆粒脫落

TSKgel UP-SW3000-LS色譜柱S次平衡后幾乎無(wú)顆粒脫落，且在顆粒脫落方面優(yōu)于其他品牌UHPLC-SEC色譜柱和光散射專用色譜柱。由于S次平衡后無(wú)法測(cè)量顆粒脫落，因此無(wú)需在開始分析前長(zhǎng)時(shí)間調(diào)節(jié)SEC色譜柱。

02
提高SEC-MS的電離效率
我們通過(guò)測(cè)定28+峰的峰面積，來(lái)定量NIST mAb單體洗脫峰在不同色譜柱上連續(xù)50次以上進(jìn)樣的MS電離效率（見圖3和圖4）。我們發(fā)現(xiàn)電離效率降低與高顆粒脫落之間具有相關(guān)性。

TSKgel UP-SW3000-LS色譜柱具有超低的高顆粒脫落率，50次以上進(jìn)樣時(shí)，可保持較高的電離效率（90%以上）。

圖3  SEC-MS分析mAb

圖4  電噴霧電離時(shí)mAb的電離效率

03
結(jié)果與討論
使用TSKgel UP-SW3000-LS色譜柱進(jìn)行SEC-MS分析，有助于減少色譜柱脫落，能夠顯著提高整體分析性能。相較于其他品牌色譜柱，還有助于通過(guò)降低ESI源的清洗頻次保證儀器的正常運(yùn)行時(shí)間。因此，使用TSKgel UP-SW3000-LS色譜柱時(shí)，不僅SEC-MS分析的重復(fù)性和可靠性更高，通量也更高。