冷凍掃描電鏡基于掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術(shù)發(fā)展而來，具有能在高真空狀態(tài)下觀察含水樣品、分辨率高、制樣簡單快速、可對樣品進(jìn)行斷裂刻蝕等優(yōu)點(diǎn)，是生命科學(xué)研究的有力工具。與同樣可以觀察含水樣品的環(huán)境掃描電鏡相比，冷凍掃描電鏡具有能在高真空狀態(tài)下觀察含水樣品、分辨率較高、可對樣品進(jìn)行斷裂刻蝕等優(yōu)點(diǎn)。

冷凍掃描電鏡的原理

　　冷凍掃描電鏡的關(guān)鍵是超低溫冷凍制樣及傳輸技術(shù)，常規(guī)掃描電鏡上可以通過加載低溫冷凍制備傳輸系統(tǒng)和冷凍樣品臺(tái)來改造升級為冷凍掃描電鏡。超低溫快速冷凍制樣技術(shù)可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，以減少冰晶的產(chǎn)生，從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu);冷凍傳輸系統(tǒng)則保證在低溫狀態(tài)下將樣品轉(zhuǎn)移至電鏡腔室并進(jìn)行觀察。其制樣過程簡單快速，無需對樣品進(jìn)行脫水、干燥，也無需使用鋨酸等有毒試劑，只需利用超低溫快速冷凍完成樣品的固態(tài)化后，通過冷凍傳輸系統(tǒng)在低溫狀態(tài)下將樣品轉(zhuǎn)移至電鏡樣品艙中的冷臺(tái)上即可觀察。此外，冷凍掃描電鏡樣品制備艙的冷凍臺(tái)上配有冷刀、加熱器和噴鍍裝置，可簡單快速地對預(yù)冷過的樣品進(jìn)行斷裂、升華、鍍金，暴露其內(nèi)部結(jié)構(gòu)以供觀察。

　　冷凍掃描電鏡的工作流程如下：①將樣品用冷凍膠水固定于樣品托上;②將樣品插入溫度低于130K的過冷液氮雪泥中快速冷凍固定，在低于130K時(shí)，水分子的移動(dòng)性非常慢以至于不能形成有害的冰晶;③在真空條件下，將樣品轉(zhuǎn)移到安裝在掃描電鏡樣品艙端口上的制樣艙中的冷臺(tái)上，根據(jù)需要進(jìn)行冷凍斷裂、冷凍升華刻蝕和濺射鍍膜等處理;④在真空條件下，將樣品轉(zhuǎn)移至掃描電鏡樣品艙中的冷臺(tái)上進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

冷凍掃描電鏡的優(yōu)點(diǎn)

　　冷凍掃描電鏡具有一系列優(yōu)點(diǎn)：

　　①能直接觀察含水和液體樣品，保持其中的可溶性物質(zhì)，對樣品的機(jī)械損傷小;

　?、谥茦舆^程快速，可在5min內(nèi)完成新鮮材料的冷凍、斷裂、噴鍍、進(jìn)入電鏡觀察;

　?、刍静皇褂糜卸驹噭?

　　④與環(huán)境掃描電鏡相比，樣品室為高真空狀態(tài)，分辨率高于前者;

　　⑤具有選擇性刻蝕能力，可通過斷裂升華顯露樣品內(nèi)在信息;

　　⑥具有重復(fù)使用樣品能力，可對樣品重復(fù)斷裂涂覆;

　?、咛貏e適合用于觀察冰淇淋等低溫樣品的超微結(jié)構(gòu)。

冷凍掃描電鏡與常規(guī)掃描電鏡比較

　　對于常規(guī)掃描電鏡而言，用于觀察的樣品必須是經(jīng)過徹底干燥處理、無水且無其他易揮發(fā)性溶劑，含水量高的樣品在掃描電鏡真空的鏡筒中將造成諸多不良后果。冷凍掃描電鏡可以不經(jīng)過干燥直接觀察含水樣品。冷凍掃描電鏡利用低溫快速冷凍技術(shù)使樣品中的水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，既減少了冰晶的產(chǎn)生，又阻止了水等揮發(fā)性液體的蒸發(fā)，從而在不影響樣品本身結(jié)構(gòu)的同時(shí)使其可以在高真空的掃描電鏡樣品艙中進(jìn)行觀察，分辨率可達(dá)到1nm。

　　常規(guī)掃描電鏡一般只能觀察組織器官的游離面和細(xì)胞的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，不能觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu);若想觀察組織和細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，需在制樣時(shí)采用特殊方法割斷組織塊，以暴露內(nèi)部結(jié)構(gòu)。而冷凍掃描電鏡樣品制備艙的冷凍臺(tái)上配有冷刀和加熱器，可以簡單快速地對預(yù)冷過的樣品進(jìn)行斷裂，再通過升華對樣品進(jìn)行選擇性蝕刻，暴露其內(nèi)部結(jié)構(gòu)以供觀察。整個(gè)過程快速，無需鋨酸處理，且進(jìn)入電鏡腔室觀察后，如不理想，可以隨時(shí)將樣品再次轉(zhuǎn)移至制樣艙進(jìn)行重復(fù)斷裂，直至目標(biāo)結(jié)構(gòu)暴露。

冷凍掃描電鏡的發(fā)展趨勢

　　冷凍掃描電鏡制樣快速簡單、可以直接觀察含水樣品，是研究高度含水的生物材料的強(qiáng)有力工具。但由于儀器的價(jià)格昂貴，其應(yīng)用還不廣泛。且冷凍掃描電鏡的制樣和操作過程對技術(shù)人員的要求較高，需要其熟悉各類樣品，能根據(jù)研究目的快速GX地選擇合適的操作條件，以捕捉快速變化的樣品表面信息。

　　目前尚未見到冷凍掃描電鏡相關(guān)的制樣方法手冊和圖集，僅能從文獻(xiàn)中獲得少量信息，從而制約了冷凍掃描電鏡技術(shù)的推廣和相關(guān)研究的深入。因此，加強(qiáng)技術(shù)人員之間的交流，開展冷凍掃描電鏡制樣方法的有益探索并匯總成實(shí)驗(yàn)手冊，對于冷凍掃描電鏡技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。

　　就冷凍掃描電鏡本身而言，如果能夠進(jìn)一步簡化儀器的操作步驟、內(nèi)置更多的標(biāo)準(zhǔn)化前處理?xiàng)l件程序供操作人員選擇，將有助于操作人員更快地操作，以便觀察易變的樣品表面和提高成像質(zhì)量。例如，如果儀器能在改變加速電壓的同時(shí)保持電子束流強(qiáng)度不變，那么操作人員就可以少控制一個(gè)變量，從而提高操作速度。此外，通過將冷凍部件與更高分辨率的掃描電鏡配套使用，可望達(dá)到更高的分辨率。