掃描電鏡是自上世紀(jì)60年代作為商用電鏡面世以來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型的電子光學(xué)儀器，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)、冶金、材料、半導(dǎo)體制造、微電路檢查等各個(gè)研究領(lǐng)域和工業(yè)部門。

掃描電鏡樣品處理方法

　　單固定半程序微波輻射法：

　　微波輻射可應(yīng)用于掃描電鏡細(xì)胞樣品的制備。處理培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程是先將一直徑為15cm、內(nèi)盛200ml水的培養(yǎng)皿置于微波爐內(nèi)，先用低檔微波輻射8min預(yù)熱，用溫度計(jì)測(cè)水溫，起始溫度約為20℃，使終止溫度為30±5℃。如果溫度超過(guò)35℃，則加冷水降溫。隨后將裝有樣品和浸泡液的小瓶放于培養(yǎng)皿內(nèi)，再繼續(xù)用微波處理2min，并使樣品保持在35℃環(huán)境中。除干燥外，固定、脫水、置換均在爐內(nèi)進(jìn)行。

　　具體步驟為：①前固定：在裝有樣品的小瓶中加入適量的2.5%的戊二醛，一般為樣品的10倍。微波輻射5min，爐外原液停留30min。②漂洗：每次微波輻射2min，爐外原液停留5min。③脫水：乙醇逐級(jí)脫水，依次為：50%，70%，90%，1**%。每次微波輻射2min，爐外原液停留5min。④置換：純乙酸異戊酯溶液置換三次，每次微波輻射2min，爐外原液停留5min。⑤干燥：CO2臨界點(diǎn)干燥。

　　該方法對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞較適用。在游離細(xì)胞超快掃描電鏡樣品制備中，還有另一種方案。在制備高等植物的掃描電鏡樣品時(shí)，建立了全程序微波輻射法，其方法與上述方法不同之處在于植物樣品的干燥也是借助微波，利用微波爐解凍檔，起始溫度為60℃，終止溫度70±3℃，干燥3~4min。

　　單固定氯化金染色法：

　　對(duì)生物樣品而言，氯化金有良好的導(dǎo)電性，但沒(méi)有固定作用，使其在掃描電鏡樣品制備中的應(yīng)用受到限制。但利用氯化金代替鋨酸，制備掃描電鏡和透射電鏡樣品，觀察結(jié)果顯示其圖像質(zhì)量符合要求。用氯化金替代鋨酸，對(duì)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行制樣。

　　具體步驟為：①固定：2.5%戊二醛固定2h。②前漂洗：0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗二次，每次10min。③后漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次10min。④浸漬染色：2%氯化金兩次，每次1.5h。⑤前漂洗：0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗2次，每次10min。⑥后漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次10min。⑦脫水：乙醇逐級(jí)脫水，依次為50%，70%，90%，1**%，1**%，每次10min。⑧置換：純乙酸異戊酯置換20min或過(guò)夜。⑨干燥：CO2臨界點(diǎn)干燥。

　　單固定快速脫水法：

　　操作程序?yàn)椋孩俟潭ǎ?.5%戊二醛固定30min。②脫水：乙醇逐級(jí)脫水，依次為：70%，90%，1**%，1**%，每次5min;③置換：純乙酸異戊酯置換5min;④干燥：CO2臨界點(diǎn)干燥。對(duì)于不同的樣品要采用合適的方法，才能得到理想的效果。

掃描電鏡細(xì)胞樣品觀察步驟

　　1、取材

　　掃描電鏡下觀察的樣品尺寸要求比較寬松，一般1cm3左右樣品都能適合大多數(shù)掃描電鏡觀察。

　　2、固定

　　鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入PBS中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3%戊二醛，在4℃固定2h或過(guò)夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預(yù)冷的1%鋨酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。

　　3、脫水

　　丙酮/醋酸異戊酯(1：1)脫水10min，接下來(lái)醋酸異戊酯脫水30min，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、1**%)脫水，每種濃度酒精通過(guò)2次，每次15min。

　　4、干燥

　　以臨界干燥法Z理想，但必須要有專門的儀器臨界點(diǎn)干燥器。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備此種儀器時(shí)，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。樣品經(jīng)上述處理后，浸入520%的乙腈溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、1**%的乙腈溶液，每次浸泡15-20min，Z后再換1**%乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺(tái)的真空裝置內(nèi)，抽低真空，一般需30-50min。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時(shí)再放氣，取出樣品。

　　5、樣品導(dǎo)電處理

　　用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，掃描電鏡樣品被安置在離蒸發(fā)源約10-15cm處的樣品臺(tái)上，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動(dòng)，先噴碳。后噴金，噴鍍應(yīng)均勻，完成后鏡下觀察。