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大鼠白血病YZ因子(LIF)酶聯免疫檢測

本文由 上海聯碩生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-21 10:01 1147閱讀次數

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大鼠白血病YZ因子(LIF)酶聯免疫檢測試劑盒使用說明書使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理,來檢測大鼠白血病YZ因子(LIF),只能用于研究用途,不得用于醫(yī)學診斷。用途:用于大鼠血清、血漿及相關液體樣本中白血病YZ因子(LIF)測定。工作原理本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品中大鼠白血病YZ因子(LIF)水平。向預先包被了大鼠白血病YZ因子(LIF)單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠白血病YZ因子(LIF),溫育;溫育后,加入生物素標記的抗LIF抗體。再與鏈霉親和素-HRP結合,形成免疫復合物,再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶,然后加入底物A、B,產生藍色,并在酸的作用下轉化成Z終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠白血病YZ因子(LIF)的濃度呈正相關。試劑盒組成試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1個1個酶標包被板1×481×962-8℃保存標準品2560ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存標準品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存鏈霉親和素-HRP3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存生物素標記的抗LIF抗體0.5ml×1瓶1ml×1瓶2-8℃保存顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存濃縮洗滌液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存需要而未提供的試劑和器材1.37℃恒溫箱。2.標準規(guī)格酶標儀。3.精密移液器及一次性吸頭4.蒸餾水,5.一次性試管6.吸水紙注意事項1.從2-8℃取出的試劑盒,在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。2.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差3.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.4.為避免交叉污染,要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。5.不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。6.底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。洗板方法手工洗板方法:甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內,浸泡1-2分鐘。根據需要,重復此過程數次。自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中標本要求1.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3YZ辣根過氧化物酶的(HRP)活性。2.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。操作程序1.標準品的稀釋:(本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)1280ng/L5號標準品120μl的原倍標準品加入120μl標準品稀釋液640ng/L4號標準品120μl的5號標準品加入120μl標準品稀釋液320ng/L3號標準品120μl的4號標準品加入120μl標準品稀釋液160ng/L2號標準品120μl的3號標準品加入120μl標準品稀釋液80ng/L1號標準品120μl的2號標準品加入120μl標準品稀釋液2.根據代測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。3.加樣:1)空白孔,空白對照孔不加樣品,生物素標記的抗LIF抗體,鏈霉親和素-HRP,只加顯色劑A&B和終止液,其余各步操作相同;2)標準品孔:加入標準品50ul,鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體,故不加);3)代測樣品孔:加入樣本40ul,然后各加入抗LIF抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul,蓋上封板膜,輕輕震蕩混勻,37℃溫育60分鐘。4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。6.顯色:每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.7.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。8.測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后10分鐘以內進行。9.根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。操作程序總結:準備試劑,樣品和標準品加入準備好的樣品和標準品,生物素標記的二抗和酶標試劑,37℃反應60分鐘洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色15分鐘加入終止液15分鐘內讀OD值計算檢測范圍:60ng/L→1280ng/L。保存:2-8℃。有效期:6個月(2-8℃)。RatLeukemiainhibitoryfactor(LIF)ELISAKitInstructionThiskitisonlyforscientificresearch,andshallnotbeusedasaclinicaldiagnosisofuse.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofLIFconcentrationsinRatserum,cellculturesupernatant,andotherbiologicalfluids.PrincipleThekitassayRatLIFlevelinthesample,addRatLIFantibodytomicrotiterplatewells,afterIncubating,addBiotinylatedantiLIF-antibody,thenCombinedStreptavidin-HRP,becomecomplex,afterIncubatingandwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolor,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofLIFinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8℃Standard:2560ng/L0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Standarddiluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Streptavidin-HRP3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃BiotinylatedantiLIF-antibody0.5ml×1bottle1ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionA3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionB3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃StopSolution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃washsolution(20ml×20fold)×1bottle(20ml×30fold)×1bottle2-8℃Materialsrequiredbutnotsupplied1.37℃incubator2.Standardmicroplatereader(450nm)3.PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.4.deionizedwater.5.DisposableTesttube6AbsorbentpaperImportantnotes1.Thekittakesoutfromtherefrigerationenvironment首ldbebalanced15-30minutesintheroomtemperature,ELISAplatescoatedifhasnotuseupafteropened,theplate首ldbestoredinSealedbag.2.addSamplewithsamplerEachstep,Andproofreaditsaccuracyfrequently,avoidstheexperimentalerror.3.Pleaseaccordingtouseinstructionstrictly,Thetestresultdeterminationmusttakethemicrotiterplatereaderasastandard.4.UsenewdisposalplasticpipettetipsandClosureplatemembraneforeachstandard,inordertoavoidcrosscontamination.5.Donotmixreagentswiththosefromotherlots.6.Thesubstrateevadethelightpreservation.Specimenrequirements1.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,and首ldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.2.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure1.Diluteandaddsample:DiluteOriginaldensityStandardasfollowtable:1280ng/L5Standard120μlOriginaldensityStandard+120μlStandarddiluent640ng/L4Standard120μl5Standard+120μlStandarddiluent320ng/L3Standard120μl4Standard+120μlStandarddiluent160ng/L2Standard120μl3Standard+120μlStandarddiluent80ng/L1Standard120μl2Standard+120μlStandarddiluent2.accordingtestingSamplenumberstodefinehowmanywellsnedd,StandardandblanksuggestedDoholes.3.addsample:1)blankwells:(blankcomparisonwellsdon’taddsample,BiotinylatedantiLIF-antibodyandStreptavidin-HRP,othereachstepoperationissame);2)Standardwells:addStandard50μlandStreptavidin-HRP50μl;3)testingSamplewells:addsample40μl,thenaddantiLIF-antibody10μl,Streptavidin-HRP50μl.closingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor60minat37℃.4.Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondiluted30-fold(or20-fold)withdistilledwaterandreserve.5.washing:UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.6.color:AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor10minat37℃7.Stopthereaction:AddStopSolution50μltoeachwell,Stopthereaction(thebluecolorchangetoyellowcolor).8.assay:takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin10min.9.CalculateofresultStepsdescriptionStandard,SamplediluentAddStandard,Samplediluent,BiotinylatedandHRP,incubatefor60minat37℃.Wash5times,AddChromogenSolutionAandB,incubatefor15minat37℃.AddStoppSolutionReadabsorbanceat450nmwithin15mincalculateAssayrange60ng/L→1280ng/LStorageandvalidity1.Storage:2-8℃.2.validity:sixmonths.

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