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ELISA試驗中陰性的顯色和陰性的本底

本文由 上海研謹生物科技有限公司 整理匯編

2018-09-04 10:00 753閱讀次數

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ELISA試驗中陰性的顯色和陰性的本底以常用的間接法測抗體和夾心法測抗原為例。陽性標本中含有檢測系統(tǒng)中特異的抗體或抗原,作為橋梁聯(lián)結免疫吸附劑和酶結合物,使酶結合物吸附在固相上,無色底物在酶的作用下轉變成有色產物,這就是陰性的顯色,顯色的深度與陽性標本中待測抗體或抗原的量成正比。陰性標本中不含待測的抗體或抗原,酶結合物不能聯(lián)結在固相上,故不顯色。但ELISA是一個復雜的、多步驟的反應過程,反應各步中酶結合物都有可能非特異性的吸附在固相載體上,與底物反應呈現(xiàn)顏色,這就形成了陰性的本底。酶結合物在固相上的非特異吸附通常有以下幾條途徑。酶結合物直接吸附在固相載體上。酶結合物是蛋白質,可以直接吸附在固相載體表面。但在ELISA這一步驟中選擇了不利于這種吸附的條件,一般說來只要酶結合物工作濃度適當和反應后經過徹底洗滌,可以避免這種吸附。酶結合物與固相上包被蛋白質成分起反應。包被抗原不純時,雜質蛋白也會吸附在固相載體上,某些雜質可與酶標抗體因“錯認"而結合。在間接法中,雜抗原還有可能與血清標本中的免疫球蛋白特異或非特異地結合。另外非特異的免疫球蛋白也可吸附在包被的特異抗原上,特別是這種抗原為堿性蛋白質時,此時酶標記的第二抗體就與吸附的免疫球蛋白反應而形成陰性本底。在間接法中標本中的非特異免疫球蛋白的含量遠遠超過特異性抗體,因此可以直接吸附在固相上,這是形成陰性本底的主要原因。聚苯乙烯對免疫球蛋白有很好的吸附性能,IgM的吸附力大于IgG,聚合IgG的吸附力大于單體的IgG。酶標記的抗Ig(二抗)對吸附在載體上的Ig和與固相抗原結合的特異性Ig有著同樣的親和力,因此在加入標本的反應中,雖然采取了不利于吸附的條件,但假設血清標本不作適量的稀釋,高濃度的Ig中仍有一些能吸附在固相上,因而產生較高的本底。在雙抗體夾心法中,標本中如含有類風濕因子,也能使陰性血清顯色。類風濕因子是作用于多種動物IgGFc段的自身抗體,多為IgM類,是一種多價抗體。在夾心法檢測中充當抗原成分,同時在固相抗體及酶標抗體反應,使酶標抗體結合到載體上。在ELISA中引入生物素-親和素系統(tǒng)可以提高檢測的靈敏度,但如果使用不當,可使本底加深,反而得不償失。生物素標記蛋白質如比例不合適,極易形成較高的陰性本底。從蛋清中提取的親和素是一種堿性糖蛋白,可以通過靜電作用吸附在聚苯乙烯上,也是造成BA-ELISA高本底的因素之一。從鏈球菌中提取的親和素改善了這一非特異吸附現(xiàn)象。上海研謹生物公司對外承接RT-PCR技術服務、細胞培養(yǎng)技術服務、原位雜交技術服務、免疫沉淀技術服務、WesternBlotting技術服務、動物模型構建服務、SCI論文服務、PCR實驗服務,并為廣大科研用戶提供各種高品質的試劑和服務,如細胞、血清、Elisa試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA產物純化試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、PCR等產品,針對以上各項服務,我們均有具有豐富服務經驗和深厚專業(yè)背景的人員團隊為您提供技術服務和支持。

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