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  77808963 2007-09-14 00:00:00

  沒聽說過，PCR如果不靠溫度變化來不斷變性、復(fù)性是很難完成的

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  大大拿0 2017-10-10 00:00:00

  基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個細(xì)胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。 PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福尼亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻(xiàn)者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來越大的作用。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。 為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫(yī)院得到推廣。 一、PCR的基本原理和基本程序 PCR擴(kuò)增DNA的原理是：先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由?、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴(kuò)增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。 PCR的擴(kuò)增倍數(shù)Y=（1+E）n，這里Y是擴(kuò)增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴(kuò)增效率。設(shè)PCR擴(kuò)增效率E為、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴(kuò)增到33554432個拷貝，即擴(kuò)增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴(kuò)增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴(kuò)增產(chǎn)物約丟失93%，若E=，n=20，則擴(kuò)增數(shù)量減少1048576個拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物約減少97%?？梢奝CR循環(huán)擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)都對擴(kuò)增數(shù)量有很大影響。PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過程遵循酶促動力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增Z初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺效應(yīng)。PCR反應(yīng)達(dá)到平臺期的時間主要取決于反應(yīng)開始時樣品中的靶DNA的含量和擴(kuò)增效率，起始模板量越多到達(dá)平臺期的時間就越短、擴(kuò)增效率越高到達(dá)平臺期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增都對到達(dá)平臺期時間有影響。 二、PCR的特點 （一）特異性高：首次報導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。 （二）高度敏感：理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實際應(yīng)用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。 （三）快速及無放射性：一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴(kuò)增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。 （四）簡便：擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個內(nèi)切酶位點，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點的載體中。 （五）可擴(kuò)增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。 三、PCR方法 （一）試劑 （1）引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生 物都有自己特異的引物。 （2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。 （3）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4，20℃)150mmol/L MgCl2，1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。 （4）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度Z好用UV吸收法精確測定?，F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。 （5）DNA模板：用處理液將待測標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測的DNA。 （二）操作程序 過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下： （1）向一微量離心管中依次加入 DNA模板 102-105拷貝 引物 各1μmol/L dNTP 各200μmol/L 10×PCR緩沖液 1/10體積 ddH2O 補到終體積（終體積50μl-100μl） 混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。 （2）加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。 （3）冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。 （4）PCR的循環(huán)程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。Z后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。 PCR尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進(jìn)行特異性的DNA擴(kuò)增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴(kuò)增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進(jìn)行了改進(jìn)。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增。 在應(yīng)用PCR方法檢測RNA病毒時，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因為PCR只能對DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。 四、PCR反應(yīng)的基本條件及其對PCR的影響 （一）模板核酸 PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。不過RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。不同來源的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴(kuò)增，處理不當(dāng)或處理過程中DNA掉失都會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測的靶DNA都會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果待擴(kuò)增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。 （二）引物 PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，引物的設(shè)計與合成對PCR的成功與否起著決定性的作用。合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。因為合成的引物中會有相當(dāng)數(shù)量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產(chǎn)物以及可檢測到的堿基修飾的完整鏈和高分子量產(chǎn)物。這些序列可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和信號強度的降低。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。凍干引物于-20℃至少保存12-24個月，液體狀態(tài)于-20℃可保存6個月。引物不用時應(yīng)存于-20℃保存。 PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴(kuò)增效果，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會出現(xiàn)假陰性。引物濃度過高會促進(jìn)引物的錯誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶，dNTP底物，從而使靶序列的擴(kuò)增量降低。一般認(rèn)為PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.2～1μmol/L為宜，但我們實驗發(fā)現(xiàn)，Z適濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此濃度。 （三）緩沖液 PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個Z適酶催反應(yīng)條件。目前Z為常用的緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8，20℃) Tris是一種雙極性離子緩沖液，20℃時其pKa值為8.3，△pKa值為-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3，20℃)在實際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應(yīng)液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9，有時會增加產(chǎn)量。 反應(yīng)混合液中50mmol/L以內(nèi)的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl則YZTaq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+，其濃度為16.6mmol/L。反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的穩(wěn)定，反應(yīng)中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）也有類似作用，尤其在擴(kuò)增長片段（此時延伸時間長）時，加入這些酶保護(hù)劑對PCR反應(yīng)是有利的。 （四）Mg2+ Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度。因為Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+。 （五）三磷酸脫氧核苷酸（dNTP） 四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。過高的dNTP濃度會導(dǎo)致聚合將其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”），因此應(yīng)當(dāng)避免。一般認(rèn)為Z適的dNTP濃度為50～200μmol/L。dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。 （六）耐熱DNA聚合酶 PCR之所以能得到廣泛應(yīng)用，主要是因為Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不僅簡化了PCR程序，也極大地增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的Z適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進(jìn)行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強度并減少了與錯配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100μl反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實驗失敗的常見原因。 （七）溫度循環(huán)參數(shù) 1．變性溫度與時間 PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高，時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應(yīng)中diyi個循環(huán)變性Z重要，需時間較長，因模板DNA的鏈比較長。 2．復(fù)性溫度與時間 變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯配，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時間并不是關(guān)鍵因素。但復(fù)性時間太長會增加非特異的復(fù)性。 3．延伸溫度與時間 引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會影響其產(chǎn)量，72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的。然而，延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴(kuò)增，延伸時間要長些。 4．循環(huán)數(shù)： 循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，Z適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環(huán)次數(shù)。另外，酶活性不好，或量不足時也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。 五、PCR標(biāo)本的制備 在將Taq DNA聚合酶引入PCR反應(yīng)，并使之達(dá)到自動化之后，PCR反應(yīng)已變得十分的簡單了。但是PCR樣品的采集及制備卻并非同樣簡單，而且，許多PCR的失敗都?xì)w因于標(biāo)本的制備不當(dāng)。用于PCR的標(biāo)本必須經(jīng)適當(dāng)處理后才能使用，因為標(biāo)本中的許多雜質(zhì)能YZTaq DNA聚合酶的活性。另外，處理標(biāo)本可使待擴(kuò)增DNA暴露，能與引物復(fù)性。關(guān)于PCR標(biāo)本制備各種專業(yè)書中介紹了許多，我們實驗發(fā)現(xiàn)操作復(fù)雜、不慎便容易造成污染，且不實用?，F(xiàn)介紹一種簡單快速的處理方法即3%異硫氰酸胍和待檢標(biāo)本混合100℃，10min，離心取上清作為PCR模板即可。 六、PCR實驗中常見問題對策 所有實驗結(jié)果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中Z常見的問題就是假陰性和假陽性問題。 （一）假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果Z常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到Y(jié)Z；引物設(shè)計不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實驗中出現(xiàn)假陰性失敗時，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時在提取PCR模板時，應(yīng)特別注意防止污染YZ酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴(kuò)增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點的設(shè)置要合理。 （二）假陽性：PCR結(jié)果的假陽性是對被檢測標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實的。因為PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。 七、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法 PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個重要手段。擴(kuò)增片段的檢測和分析才是目的，根據(jù)研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，點雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，Z近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA，PCR-EIA，PCR-OLA等）均有助于產(chǎn)物的精確分析。 （一）凝膠電泳分析法 PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者Z常用，通過電泳可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴(kuò)增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解，稍冷后倒入電泳槽。 電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照。 凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測擴(kuò)增的情況，還可以用來純化擴(kuò)增產(chǎn)物。 （二）點雜交 當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認(rèn)識某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗，用非放射性物質(zhì)（生物素、熒光素和等）標(biāo)記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測速度快。 （三）微孔板夾心雜交法 該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達(dá)5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA，適于臨床實驗室常規(guī)應(yīng)用。 （四）PCR-ELISA法 本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因為5'端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。

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