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  chenxsong521 2015-11-24 00:00:00

  diyi天 17：00：后用接種環(huán)取一單克隆細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)液中，37°C搖床過(guò)夜（不要超過(guò)16小時(shí)） 第二天 7：30：打開(kāi)紫外燈，照射半小時(shí)（將器械放入通風(fēng)櫥中）；8：00：將20mL的LB培養(yǎng)液放入250mL的三角燒瓶中，按1：100的比例稀釋過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)（即放入200ul 的細(xì)菌液體），將其放入37°C搖床，培養(yǎng)約3.5個(gè)小時(shí)；11：00：打開(kāi)紫外燈，照射半小時(shí)；11：30：取10μL陽(yáng)性噬菌體液加至20mL細(xì)菌培養(yǎng)物中（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期），再放入搖床中37°C劇烈搖動(dòng)（300轉(zhuǎn)/分）4.5小時(shí)；15：30：打開(kāi)紫外燈，照射半小時(shí)。同時(shí)讓高速離心機(jī)預(yù)溫；16：00：將三角燒瓶中培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至一離心管中，40°C ，10，000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一干凈離心管中，再次離心。吸取部分上清按1：1的比例和甘油混合保種，放在－200C保存。吸取80％上清至另一離心管中，加1/6體積PEG/NACL，于40°C過(guò)夜；17：00用接種環(huán)取一單克隆細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)液中，37°C搖床過(guò)夜（不要超過(guò)16小時(shí)）。 第三天 7：30：打開(kāi)紫外燈，照射半小時(shí)（將器械放入通風(fēng)櫥中）； 8：00：按1：100的比例稀釋過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌（將50μl的細(xì)菌培養(yǎng)物放入5mlLB中）將其放入370C搖床，培養(yǎng)約3.5小時(shí)；8：30：打開(kāi)紫外燈，照射半小時(shí)（將器械放入通風(fēng)櫥中），同時(shí)讓高速離心機(jī)預(yù)溫；9：00：40°C 10，000rpm離心15min，棄上清。加1mlTBS重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移至微量離心管中，加1/6體積的PEG/NACL再次沉淀，在冰上孵育15－60min，離心棄上清，加200ulTBS重懸沉淀，此為陽(yáng)性噬菌體擴(kuò)增液。經(jīng)幾輪擴(kuò)增至所需的滴度；10：30：將IPTG/Xgal平皿板放入37°C恒溫箱中預(yù)溫，準(zhǔn)備水浴箱等測(cè)滴度用品；11：00：用LB培養(yǎng)液以100/1000倍系列稀釋噬菌體。微波爐中溶化頂層膠，每3mL分裝在一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)管中，每個(gè)稀釋度的噬菌體一個(gè)，將這些培養(yǎng)管置于45°C水浴中備用；11：30：每200ul細(xì)菌培養(yǎng)物分裝到微量離心管中。每個(gè)噬菌體稀釋度10uL分別加到上述細(xì)菌培養(yǎng)物中，室溫下孵育1－5分鐘。轉(zhuǎn)到上述含頂層膠的無(wú)菌培養(yǎng)管中，快速混懸，立即鋪到預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平皿上，傾斜平皿使頂層膠鋪勻。室溫下冷卻平皿5min，倒置，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。 第四天 噬斑計(jì)數(shù)，以每個(gè)平皿100個(gè)左右為Z佳的稀釋度。噬菌體滴度＝噬斑數(shù)×稀釋度（pfu/10uL）

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