市場常見色譜柱惰性比較

• lingxian的3μm、小孔徑C18色譜柱品牌

• 50 x 2.1 mm i.d.LC/MS兼容尺寸

• 堿性分子惰性測試

• 峰柱效和不對稱性研究

峰柱效比較  

結(jié)論
當分析吡啶（一種高堿性小分子）時，可以看到柱效、峰形和選擇性的顯著差異。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相上表面的硅醇基之間存在不受歡迎的次級相互作用。

這些相互作用也可能導致色譜柱可重現(xiàn)性不佳。
之前已對ACE C18色譜柱進行了獨立測試，發(fā)現(xiàn)具有出色的柱效和ji致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了這一優(yōu)異性能。

ACE?固定相幾乎消除了硅醇基對HPLC分離的不利影響

進一步的惰性測試數(shù)據(jù)包含在ACE HPLC色譜柱目錄中。

此外，還提供了C18柱比較指南，其詳細介紹了超過50種HPLC色譜柱品牌的材料特性，并將性能與許多測試探針進行了比較。

請聯(lián)系菲羅門索取資料。

具有獨特選擇性的C18 鍵合相：
1.有保證的可重現(xiàn)性
2.的鍵合相穩(wěn)定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

改善色譜分離度
色譜分離的目標是在Z短的時間內(nèi)獲得目標組分的足夠分離度（Rs）。

1.5的分離度可以實現(xiàn)基線分離，然而對于可以在實驗室之間易于轉(zhuǎn)換的耐用、可重法而言，理想的分離度是1.8-2.0。
分離度方程告訴我們什么變量可以影響分離度：

增加分離度Rs可以通過增加N、α或k來實現(xiàn)。

然而，如圖1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回報率快速下降。

例如，Rs僅隨著N平方根的增加而增加。

可以通過增加柱長或降低柱填充材料的粒徑或兩者的某種組合來增加N。

無論哪種方式，系統(tǒng)背壓隨著N的增加而增加，因此通過增加N實現(xiàn)令人滿意的分離，其“成本”可能是極高的壓力。
同樣，增加保留值（k值）將會增加Rs，但回報率也快速下降。

將k增加至超過10通常是Rs與分析時間之間的不利權(quán)衡，因為只有Rs的邊際收益隨著保留時間的增加而實現(xiàn)。

該效應(yīng)的圖形表示參見下述圖1。

圖1 N、α和k對分離度(Rs)的影響
對于典型的分離，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分離度(Rs)。

然而，從這些圖中可以看出，N或k的提高都會迅速降低回報率。
另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發(fā)分離方法時的Z佳優(yōu)化變量。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不會受回報率下降的約束。

α的變化對壓力沒有影響，對分離時間的影響也是微乎其微的（參見圖2）。

因此，在開發(fā)分離方法時，α是Z重要的變數(shù)。

優(yōu)化α可以使您在所有目標峰之間達到滿意的分離度，同時保持系統(tǒng)背壓和分離時間在可接受范圍內(nèi)。

改善色譜分離度- 選擇性或柱效？
選擇性(α)由流動相、溫度和固定相化學物質(zhì)控制。大多數(shù)方法開發(fā)策略將探索所有這些色譜變量。
如果使用“標準”3μm C18相沒有達到足夠的分離度，推薦優(yōu)化分離的色譜選擇性而不是分離柱效，如下述實例所示。
通過簡單地將固定相化學物質(zhì)（即色譜柱）改變?yōu)榫哂刑娲V選擇性的固定相化學物質(zhì)，易于在標準HPLC系統(tǒng)上獲得所需分離度，而無需昂貴的UHPLC儀器。

另外，也可以避免復雜的流動相組分、升高的溫度和侵蝕性pH條件。

圖2利用選擇性實現(xiàn)快速、高分離度的分離

樣品：1）對乙酰氨基酚2）氫氯噻嗪3）甲基苯基亞砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 溫度：40°C 檢測：UV, 254 nm 流動相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分鐘內(nèi)3- B
比較數(shù)據(jù)不代表所有應(yīng)用。

在保持C18鍵合相的同時，將粒徑從3μm減小至2μm以下，并不能顯著改善分離效果，另外也會導致壓力明顯增加。
ACE C18-PFP色譜柱為3個關(guān)鍵對提供了更佳的選擇性(α)，因此與2μm以下的C18色譜柱相比，其可以提供的分離效果，即使2μm以下的色譜柱可以提供更高的柱效。
與使用具有高塔板數(shù)和高壓的色譜柱嘗試進行峰分離所獲得的結(jié)果相比，利用選擇性的能力可以獲得更佳的分離效果。

PFP分離機制
ACE C18-PFP相顯示有多個保留機制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性。

雖然下述部分提供了相對強度的近似值，但每個保留機制的優(yōu)勢由溶質(zhì)的物理/化學性質(zhì)、其結(jié)構(gòu)和所采用的色譜條件決定。

π-π相互作用

PFP環(huán)在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因為電負性氟原子會產(chǎn)生缺電子的苯環(huán)，使得PFP相可以作為路易斯酸而起作用。

這將與能夠給出電子的分析物（即路易斯堿）相互作用。
這與苯基相相反，苯基相含有富電子芳香環(huán)（由于不存在吸電子基團），因此它們可以作為路易斯堿而起作用。

偶極-偶極和氫鍵

PFP環(huán)中的碳-氟鍵具有強極性。

因此，PFP相可以通過在分析物與電負性氟原子之間發(fā)生的偶極-偶極或氫鍵相互作用來額外保留分析物。

任何這樣的相互作用將導致保留增加。

形狀選擇性

PFP具有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)，當與其它可能的保持機制相結(jié)合時，可以賦予PFP相優(yōu)異的形狀選擇性。

ACE C18-PFP相顯示有PFP相的多重保留機制，色譜科學家們可能會利用這些機制來解決在傳統(tǒng)C18相（僅主要依賴于疏水保留機制）上難以分離（即使并非不可能）的混合物。

ACE? Excel? 色譜柱

ACE Excel 2μm UHPLC色譜柱

• 與所有市售UPLC和UHPLC儀器完全兼容

• 為UHPLC色譜柱提供口碑zhuo越的ACE HPLC色譜柱優(yōu)勢

• 為UPLC/UHPLC使用者提供了更多選擇的固定相，包括強大的C18-AR和C18-PFP相

• 提供高水平的可靠性和耐用性

• 提供從UHPLC到HPLC再至制備型LC的易擴展性

• 適用于UHPLC的2、3和5μm粒徑

制造UHPLC色譜柱是比較困難的，且通常認為它們不像HPLC色譜柱那樣耐用和可靠。

憑借其在制造Z優(yōu)質(zhì)HPLC色譜柱方面的豐富經(jīng)驗，Advanced Chromatography Technologies能夠生產(chǎn)出非常可靠的UHPLC色譜柱。

現(xiàn)在，色譜分析師將從UPLC和UHPLC儀器中獲得更多的成果。UPLC和UHPLC使用者利用ACE ExcelUHPLC色譜柱現(xiàn)可以獲得堿性化合物的峰形、改善柱間的可重現(xiàn)性、獲得利用多種分離機制的附加固定相以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel提供zhuo越的分離度和峰形

條件
流動相A = 5mM甲酸（溶于水中）和B = 5mM甲酸（溶液甲醇中）梯度5分鐘內(nèi)3-100％B
流速：0.6 ml/min
溫度：40 ℃
檢測：UV, 254 nm
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm

Analytes
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯基砜
5. 阿司匹林

6. 非那西丁
7. 1,3-二硝基苯
8. 1,2,4-三甲氧基苯
9. 苯甲酸乙酯
10. 尼美舒利

11. 布洛芬
12. 吲哚美辛
13. 甲芬那酸

這些比較性色譜圖顯示，C18鍵合相不能將所有13種分析物完全分離。由于其額外的分離機制，ACE Excel C18-PFP能夠基線分離所有分析物。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE?是Advanced Chromatography Technologies Limited的注冊商標。
ACE ExcelTM和HSCTM是Advanced Chromatography Technologies Limited的商標。
Advanced Chromatography Technologies Limited承認Advanced Scientific Instruments、Agilent Technologies Inc.、Alltech AssociatesInc.、GL Sciences Inc.、Idex Health＆Science LLC、Phenomenex Inc.、Shimadzu Corporation、Thermo Fisher Scientific和Waters Corporation的注冊和未注冊商標，且與上述這些公司沒有任何隸屬關(guān)系。

ACE Excel UHPLC色譜柱與所有市售UPLC和UHPLC儀器兼容

Thermo Scientic Accela

Dionex UltiMate 3000

Waters

• Acquity UPLC

• Acquity UPLC H–Class

• Acquity UPLC I–Class

安捷倫科技

• 1290 Infinity

• 1220 Infinity

• 1260 Infinity
  

• 1200 Infinity

島津

• Nexera

• Prominence

加上許多其他品牌的UHPLC儀器，恕不能一一列舉

ACE色譜柱超惰性固定相對生物分子反相HPLC的益處

增加PH范圍
大多數(shù)生物分子是帶電荷的。

肽類和蛋白質(zhì)帶有多種電荷。從小分子的經(jīng)驗來看，已流動相pH可以成為改變保留值并因此而優(yōu)化帶電化合物分離度的有力工具。

肽類也是如此。

再次以使用血管緊張素II和III作為實例，下圖顯示在pH=2的條件下，ACE超惰性色譜柱或填充有更具活性固定相的色譜柱上這兩種肽未實現(xiàn)分離。

通過將pH增加至7，這兩種色譜柱則均能提供良好的分離度。

然而，盡管ACE超惰性色譜柱保持了良好的峰形，但填充低純度硅膠的色譜柱顯示其峰形較差和性能損失。

在極性化合物的許多反相應(yīng)用中觀察到了這種現(xiàn)象。

在中等pH值時，硅醇相互作用更為普遍，因此峰拖尾在活性固定相上變得更加明顯。

流動相pH對分離度的影響

色譜柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300?
流動相：

pH 2 A：0.1% TFA（溶于水中） B: 0.1% TFA（溶于乙腈中）
pH 7 A: 10mM NH4OAc（溶于水中） B: 乙腈 15分鐘內(nèi)25%-40% B
流速：1.0 mL/min

檢測：UV 215nm
化合物：

1.血管緊張素II
2.血管緊張素III
3.血管緊張素I

調(diào)節(jié)流動相的pH是提高選擇性的有力工具。只有基于超純硅膠的色譜柱才能在更高的pH值下保持性能。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE色譜柱超惰性固定相對生物分子反相HPLC的益處
提高靈敏度
將TFA（三氟乙酸）用作肽類和蛋白質(zhì)反相分離的流動相添加劑。
該添加劑通常被用于改善肽類和蛋白質(zhì)復雜混合物的峰形和分離度。

如下圖所示，在流動相中使用0.1％TFA可以使填充有活性固定相的色譜柱產(chǎn)生與由超惰性固定相制備的新一代色譜柱相當?shù)姆鍖挕?/p>

然而，隨著TFA濃度降低至0.01％以及Z終的0.005％，超惰性相上的峰寬保持不變，但活性固定相上的峰寬會發(fā)生變形。
使用極低水平TFA分析肽類和蛋白質(zhì)的能力有利于采用質(zhì)譜法進行高靈敏度檢測。

TFA可與多肽形成復合物合并增強選擇性。然而，該相同的復合作用會降低質(zhì)譜儀的靈敏度。

用于肽類和蛋白質(zhì)分析的ACE 300?色譜柱

蛋白質(zhì)
條件
色譜柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
溫度：環(huán)境
流動相：A. 0.1% TFA（溶于水中） B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），30分鐘內(nèi) 5%-70% B
檢測：UV, 280nm

化合物
1. 核糖核酸酶A
2. 細胞色素C
3. 全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白
4. 脫輔基肌紅蛋白

肽類

條件
色譜柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
溫度：環(huán)境
流動相：A. 0.1% TFA（溶于水中）B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），25分鐘內(nèi)10%-40% B
檢測：UV, 220nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催產(chǎn)素
3. 血管緊張素II
4. 神經(jīng)降壓素

靈敏度和峰形，隨TFA的濃度而變化

色譜柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300?
流動相：A：TFA（溶于水中） B： 溶于乙腈中的TFA（按照上述說明為％TFA），37.5分鐘內(nèi)10％-55％B。
流速：1.5mL/min
檢測：UV 200nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催產(chǎn)素
3. 血管緊張素II
4. 神經(jīng)降壓素

隨著TFA濃度的降低，低純度硅膠色譜柱（右圖）顯示性能急劇下降。
由超惰性硅膠制成的色譜柱（如ACE）會在TFA濃度降低時保持性能。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE色譜柱超惰性固定相對生物分子反相HPLC的益處

優(yōu)化選擇性
TFA和其他流動相添加劑與肽類和蛋白質(zhì)的復合能力可用于調(diào)節(jié)選擇性并改善分離度。如下圖所示，將TFA濃度從0.1％降低至0.01％可使血管緊張素II和III實現(xiàn)分離。

在超惰性ACE色譜柱的情況下，隨著分離度的顯著改善，峰形和靈敏度保持恒定。在Vydac色譜柱（填充有更具活性的固定相）的情況下，峰形被嚴重破壞。

選擇性，隨TFA的濃度而變化

色譜柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300?
流動相：A：TFA（溶于水中）B: 80％TFA（溶于乙腈中），20％TFA（溶于水中），（按照上述說明為％TFA），15分鐘內(nèi)25％-40％B
流速：1.0 mL/min

檢測：UV 215nm
化合物：

1.血管緊張素II
2.血管緊張素III
3.血管緊張素I

通過降低TFA濃度來改善分離度。由低品質(zhì)硅膠制成的色譜柱顯示其性能降低。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

色譜柱ACE

ACE色譜柱保護柱安裝使用說明

ACE獨立式保護柱套是專為內(nèi)徑為1.0 - 4.6mm 的 ACE HPLC色譜柱而設(shè)計的，與ACE柱耦合器 (C0001)配合使用。

ACE色譜柱保護柱安裝使用說明

1. 將保護柱芯放入柱套螺紋較短的那一半內(nèi)。

保護柱芯是非定向的。

2. 用手將兩半的柱套擰緊直至感覺到阻力為止，

然后再用扳手擰緊四分支一圈。

3. 將柱套螺旋紋較短的那一端與手擰柱耦合器  (C0001)一起連接到分析柱上。

這里請用手擰緊，千萬不要用扳手。

4. 如果在加壓后，兩半柱套之間發(fā)現(xiàn)有滲漏的情況，請用扳手小心地將兩半稍稍擰緊，直到滲漏 停止。

5. 如果在加壓后，柱子和保護柱套之間有任何滲漏的情況，請用手小心地擰緊直到滲漏停止。

6. 柱耦合器(C0001)的活動中軸是自適應(yīng)無實體積匹配各種色譜柱頭，切勿抽出遺失。切勿讓該配件非均 勻受力，以免折斷。

ACE HILIC法開發(fā)平臺和工作實例

圖17顯示了HILIC方法開發(fā)的流程圖。
一般方法是：收集分析物相關(guān)的信息（如果已知的話），針對三個ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色譜柱在不同的pH洗脫液條件下）執(zhí)行梯度或等度HILIC篩選實驗（取決于樣本分析物的親水性范圍），然后再優(yōu)化色譜法以達到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC篩選條件。

這些設(shè)計旨在探索廣泛的選擇性范圍，以及為達到所需分離提供一個良好的起點。

圖17
ACE HILIC 方法開發(fā)流程圖

表1
ACE HILIC篩選實驗的條件

ACE HILIC色譜柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色譜柱應(yīng)使用體積比為7:3的乙腈和水進行沖洗，清除掉所有的緩沖鹽。

然后，使用的異丙醇、以更低的流速進行沖洗，以便貯存。應(yīng)往回擰緊色譜柱端蓋（擰緊色譜柱端蓋），并將色譜柱放回盒內(nèi)。

每次分析運行之后，除非第二天要使用，否則建議采用密閉法（按長期保存的方法）清洗色譜柱，然后用異丙醇沖洗。

實例1 – 咖啡茵和相關(guān)化合物

方法開發(fā)中所需的咖啡茵和四種相關(guān)化合物（可可堿、茶堿、次黃嘌呤和黃嘌呤）這些化合物都是極性的中性物質(zhì)，其中負log P值表示合理的親水性（log P為負值明確的表明其親水性），因此適用于HILIC（圖18）。

圖18
咖啡茵和相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和log P數(shù)據(jù)

咖啡茵和相關(guān)化合物在pH為3-6的情況下不可電離，因此洗脫劑的pH幾乎不會直接影響分子。

為此，選擇pH 3.0和4.7。

固定相會受洗脫劑pH變化的影響，這可能是有利的一面。

固定相的電離變化將影響粒子周圍的水合層，這會影響分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氫鍵的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情況下對三個固定相進行篩選，結(jié)果如圖19中所示。
新的ACE HILIC色譜柱使用60倍柱體積相互平衡（平衡），以在粒子周圍形成水合層。表1中顯示了流動相、梯度和溫度。
篩選結(jié)果顯示：三個固定相與兩個pH值之間觀察到一些選擇性差異（三個固定相在兩個pH值下的篩選結(jié)果可以看出彼此間具有選擇性的差異）。

基于篩選數(shù)據(jù)的Z有效分離是針對pH為3.0下的（pH為3.0下的）ACE HILIC-N相。

這些數(shù)據(jù)選擇（選定這些條件）用于進一步優(yōu)化。

圖19
ACE HILIC色譜柱的梯度篩選

條件如表1中所述，275nm條件下的檢測除外。進樣25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸銨，以0.5%w/w的比例混合相關(guān)物質(zhì)和MeCN/H2O（90:10 v/v））
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

較早洗脫峰的保留窗口（時間段）非常窄，這表示：等度HILIC可用于分離分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分離這些化合物）10mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被選為等度條件（圖20）。

在這些條件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分離）。
根據(jù)梯度運行的結(jié)果，乙腈含量更高似乎不會提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量沒有提高2與3峰的分離度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是對混合物分離有更合適的，溫度將被研究），從而開發(fā)出Z終方法，如圖21所示。

圖20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關(guān)化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關(guān)化合物的等度分析
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 275 nm
進樣：2 μL
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

溫度的降低會提高茶堿與可可堿之間的解析度（分離度），因此，Z終方法（圖21）被認為適合其用途。

圖21
Z終開發(fā)方法：

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：A = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分鐘內(nèi)，B持續(xù)5分鐘，下一次進樣維持在起始條件20分鐘
流速：1.5 mL/min
溫度：15 °C
檢測：275 nm
進樣：2 μL

實例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（圖22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在為體內(nèi)細胞提供能量方面起著重要作用（在體內(nèi)主要用于為細胞供能），并形成（生成）副產(chǎn)品肌酐。測定血液中的肌酐，確定腎功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示腎可能不會完全過濾廢物。（升高表明腎的過濾廢物的功能有所降低）

圖22
結(jié)構(gòu)和log P肌酸和肌酐數(shù)據(jù)

圖23
使用pH為3.0、4.7和6.0的甲酸銨對ACE HILIC范圍的等度篩選對比
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三種pH值條件下，利用等度條件對三個HILIC固定相的兩種分析物進行篩選。

結(jié)果表明：肌酐在三個ACE HILIC相中被適當?shù)乇Ａ?，但由于過度保留的原因，肌酸在合理的時間內(nèi)沒有洗脫。

根據(jù)圖17中的流程圖，過度保留窗口表示梯度（寬時間段表明梯度方法）可能更適宜。

圖24
ACE HILIC-A相下的Z終方法

ACE HILIC-A在pH3.0下選擇，進行梯度分析。

標準梯度在10分鐘內(nèi)析出兩種目標分析物，并且解析度很高（分離度很高）（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，這使得梯度時間進一步減少（這種情況下可以使梯度運行時間進一步減少），從而縮短了整體運行時間。

Z終方法如圖24中所示。

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動相：
A：2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分鐘內(nèi)
流速：1.5 mL/min
檢測：230 nm
進樣：5 μL
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

結(jié)論

HILIC是一種用于多用途的極性分析物色譜分析法（對于極性化合物來說是一種通用的色譜分析模式）。

這種方法比較復雜，但如果遵循簡單規(guī)則，則可實現(xiàn)可再現(xiàn)的HILIC方法（HILIC方法是可以重現(xiàn)性的）。

三個ACE HILIC相（固定相）設(shè)計用于HILIC方法開發(fā)期間研究選擇性，并盡可能快地提供實現(xiàn)所需分離的選項。

ACE HILIC方法驗證協(xié)議（規(guī)程）已成功用于開發(fā)一系列的HILIC方法，應(yīng)為HILIC方法開發(fā)活動提供一種結(jié)構(gòu)化的方法。

柱體積為LC柱內(nèi)被洗脫劑占據(jù)的體積（即粒子之間的空間和粒子孔內(nèi)空間）。

柱體積可根據(jù)以下公式計算：

Vm=πr2 Lε

其中：

Vm = 柱體積（單位：mL）

 r = 柱半徑（單位：cm）
L = 柱長度（單位：cm）

ε = 床層空隙度值

床層空隙度值ε取決于粒子參數(shù)（如孔徑、表面積等）和供應(yīng)商。

對于ACE 100 ?多孔柱，ε值為~0.63；

對于ACE 300 ?多孔柱，ε值為~0.75；

而對于ACE 90 ?實芯柱，ε值為~0.55.
在討論柱平衡時，更準確的是引用達到穩(wěn)定狀態(tài)所需的柱體積，因為它與流速和柱尺寸（規(guī)格）無關(guān)。

例如，表1a示出了一系列ACE 100 ?多孔柱的柱體積值的計算。  

表 1a：ACE 100 ?多孔柱的體積計算值（單位：mL）

表2a顯示了各種流速條件下，4個不同尺寸的ACE 100 ?多孔柱達到20和60倍柱體積平衡所需的時間。

表 2a：ACE 100 ?多孔柱平衡計算