ACE色譜柱保護(hù)柱安裝使用說明

ACE獨(dú)立式保護(hù)柱套是專為內(nèi)徑為1.0 - 4.6mm 的 ACE HPLC色譜柱而設(shè)計(jì)的，與ACE柱耦合器 (C0001)配合使用。

ACE色譜柱保護(hù)柱安裝使用說明

1. 將保護(hù)柱芯放入柱套螺紋較短的那一半內(nèi)。

保護(hù)柱芯是非定向的。

2. 用手將兩半的柱套擰緊直至感覺到阻力為止，

然后再用扳手?jǐn)Q緊四分支一圈。

3. 將柱套螺旋紋較短的那一端與手?jǐn)Q柱耦合器  (C0001)一起連接到分析柱上。

這里請(qǐng)用手?jǐn)Q緊，千萬不要用扳手。

4. 如果在加壓后，兩半柱套之間發(fā)現(xiàn)有滲漏的情況，請(qǐng)用扳手小心地將兩半稍稍擰緊，直到滲漏 停止。

5. 如果在加壓后，柱子和保護(hù)柱套之間有任何滲漏的情況，請(qǐng)用手小心地?cái)Q緊直到滲漏停止。

6. 柱耦合器(C0001)的活動(dòng)中軸是自適應(yīng)無實(shí)體積匹配各種色譜柱頭，切勿抽出遺失。切勿讓該配件非均 勻受力，以免折斷。

色譜柱ACE

ACE? Excel? 色譜柱

ACE Excel 2μm UHPLC色譜柱

• 與所有市售UPLC和UHPLC儀器完全兼容

• 為UHPLC色譜柱提供口碑zhuo越的ACE HPLC色譜柱優(yōu)勢(shì)

• 為UPLC/UHPLC使用者提供了更多選擇的固定相，包括強(qiáng)大的C18-AR和C18-PFP相

• 提供高水平的可靠性和耐用性

• 提供從UHPLC到HPLC再至制備型LC的易擴(kuò)展性

• 適用于UHPLC的2、3和5μm粒徑

制造UHPLC色譜柱是比較困難的，且通常認(rèn)為它們不像HPLC色譜柱那樣耐用和可靠。

憑借其在制造Z優(yōu)質(zhì)HPLC色譜柱方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，Advanced Chromatography Technologies能夠生產(chǎn)出非?？煽康腢HPLC色譜柱。

現(xiàn)在，色譜分析師將從UPLC和UHPLC儀器中獲得更多的成果。UPLC和UHPLC使用者利用ACE ExcelUHPLC色譜柱現(xiàn)可以獲得堿性化合物的峰形、改善柱間的可重現(xiàn)性、獲得利用多種分離機(jī)制的附加固定相以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel提供zhuo越的分離度和峰形

條件
流動(dòng)相A = 5mM甲酸（溶于水中）和B = 5mM甲酸（溶液甲醇中）梯度5分鐘內(nèi)3-100％B
流速：0.6 ml/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV, 254 nm
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm

Analytes
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯基砜
5. 阿司匹林

6. 非那西丁
7. 1,3-二硝基苯
8. 1,2,4-三甲氧基苯
9. 苯甲酸乙酯
10. 尼美舒利

11. 布洛芬
12. 吲哚美辛
13. 甲芬那酸

這些比較性色譜圖顯示，C18鍵合相不能將所有13種分析物完全分離。由于其額外的分離機(jī)制，ACE Excel C18-PFP能夠基線分離所有分析物。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE?是Advanced Chromatography Technologies Limited的注冊(cè)商標(biāo)。
ACE ExcelTM和HSCTM是Advanced Chromatography Technologies Limited的商標(biāo)。
Advanced Chromatography Technologies Limited承認(rèn)Advanced Scientific Instruments、Agilent Technologies Inc.、Alltech AssociatesInc.、GL Sciences Inc.、Idex Health＆Science LLC、Phenomenex Inc.、Shimadzu Corporation、Thermo Fisher Scientific和Waters Corporation的注冊(cè)和未注冊(cè)商標(biāo)，且與上述這些公司沒有任何隸屬關(guān)系。

ACE Excel UHPLC色譜柱與所有市售UPLC和UHPLC儀器兼容

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加上許多其他品牌的UHPLC儀器，恕不能一一列舉

市場(chǎng)常見色譜柱惰性比較

• lingxian的3μm、小孔徑C18色譜柱品牌

• 50 x 2.1 mm i.d.LC/MS兼容尺寸

• 堿性分子惰性測(cè)試

• 峰柱效和不對(duì)稱性研究

峰柱效比較  

結(jié)論
當(dāng)分析吡啶（一種高堿性小分子）時(shí)，可以看到柱效、峰形和選擇性的顯著差異。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相上表面的硅醇基之間存在不受歡迎的次級(jí)相互作用。

這些相互作用也可能導(dǎo)致色譜柱可重現(xiàn)性不佳。
之前已對(duì)ACE C18色譜柱進(jìn)行了獨(dú)立測(cè)試，發(fā)現(xiàn)具有出色的柱效和ji致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了這一優(yōu)異性能。

ACE?固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)HPLC分離的不利影響

進(jìn)一步的惰性測(cè)試數(shù)據(jù)包含在ACE HPLC色譜柱目錄中。

此外，還提供了C18柱比較指南，其詳細(xì)介紹了超過50種HPLC色譜柱品牌的材料特性，并將性能與許多測(cè)試探針進(jìn)行了比較。

請(qǐng)聯(lián)系菲羅門索取資料。

ACE HILIC法開發(fā)平臺(tái)和工作實(shí)例

圖17顯示了HILIC方法開發(fā)的流程圖。
一般方法是：收集分析物相關(guān)的信息（如果已知的話），針對(duì)三個(gè)ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色譜柱在不同的pH洗脫液條件下）執(zhí)行梯度或等度HILIC篩選實(shí)驗(yàn)（取決于樣本分析物的親水性范圍），然后再優(yōu)化色譜法以達(dá)到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC篩選條件。

這些設(shè)計(jì)旨在探索廣泛的選擇性范圍，以及為達(dá)到所需分離提供一個(gè)良好的起點(diǎn)。

圖17
ACE HILIC 方法開發(fā)流程圖

表1
ACE HILIC篩選實(shí)驗(yàn)的條件

ACE HILIC色譜柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色譜柱應(yīng)使用體積比為7:3的乙腈和水進(jìn)行沖洗，清除掉所有的緩沖鹽。

然后，使用的異丙醇、以更低的流速進(jìn)行沖洗，以便貯存。應(yīng)往回?cái)Q緊色譜柱端蓋（擰緊色譜柱端蓋），并將色譜柱放回盒內(nèi)。

每次分析運(yùn)行之后，除非第二天要使用，否則建議采用密閉法（按長(zhǎng)期保存的方法）清洗色譜柱，然后用異丙醇沖洗。

實(shí)例1 – 咖啡茵和相關(guān)化合物

方法開發(fā)中所需的咖啡茵和四種相關(guān)化合物（可可堿、茶堿、次黃嘌呤和黃嘌呤）這些化合物都是極性的中性物質(zhì)，其中負(fù)log P值表示合理的親水性（log P為負(fù)值明確的表明其親水性），因此適用于HILIC（圖18）。

圖18
咖啡茵和相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和log P數(shù)據(jù)

咖啡茵和相關(guān)化合物在pH為3-6的情況下不可電離，因此洗脫劑的pH幾乎不會(huì)直接影響分子。

為此，選擇pH 3.0和4.7。

固定相會(huì)受洗脫劑pH變化的影響，這可能是有利的一面。

固定相的電離變化將影響粒子周圍的水合層，這會(huì)影響分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氫鍵的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情況下對(duì)三個(gè)固定相進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖19中所示。
新的ACE HILIC色譜柱使用60倍柱體積相互平衡（平衡），以在粒子周圍形成水合層。表1中顯示了流動(dòng)相、梯度和溫度。
篩選結(jié)果顯示：三個(gè)固定相與兩個(gè)pH值之間觀察到一些選擇性差異（三個(gè)固定相在兩個(gè)pH值下的篩選結(jié)果可以看出彼此間具有選擇性的差異）。

基于篩選數(shù)據(jù)的Z有效分離是針對(duì)pH為3.0下的（pH為3.0下的）ACE HILIC-N相。

這些數(shù)據(jù)選擇（選定這些條件）用于進(jìn)一步優(yōu)化。

圖19
ACE HILIC色譜柱的梯度篩選

條件如表1中所述，275nm條件下的檢測(cè)除外。進(jìn)樣25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸銨，以0.5%w/w的比例混合相關(guān)物質(zhì)和MeCN/H2O（90:10 v/v））
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

較早洗脫峰的保留窗口（時(shí)間段）非常窄，這表示：等度HILIC可用于分離分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分離這些化合物）10mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被選為等度條件（圖20）。

在這些條件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分離）。
根據(jù)梯度運(yùn)行的結(jié)果，乙腈含量更高似乎不會(huì)提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量沒有提高2與3峰的分離度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是對(duì)混合物分離有更合適的，溫度將被研究），從而開發(fā)出Z終方法，如圖21所示。

圖20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關(guān)化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關(guān)化合物的等度分析
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流動(dòng)相：10 mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測(cè)：UV, 275 nm
進(jìn)樣：2 μL
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

溫度的降低會(huì)提高茶堿與可可堿之間的解析度（分離度），因此，Z終方法（圖21）被認(rèn)為適合其用途。

圖21
Z終開發(fā)方法：

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動(dòng)相：A = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分鐘內(nèi)，B持續(xù)5分鐘，下一次進(jìn)樣維持在起始條件20分鐘
流速：1.5 mL/min
溫度：15 °C
檢測(cè)：275 nm
進(jìn)樣：2 μL

實(shí)例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（圖22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在為體內(nèi)細(xì)胞提供能量方面起著重要作用（在體內(nèi)主要用于為細(xì)胞供能），并形成（生成）副產(chǎn)品肌酐。測(cè)定血液中的肌酐，確定腎功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示腎可能不會(huì)完全過濾廢物。（升高表明腎的過濾廢物的功能有所降低）

圖22
結(jié)構(gòu)和log P肌酸和肌酐數(shù)據(jù)

圖23
使用pH為3.0、4.7和6.0的甲酸銨對(duì)ACE HILIC范圍的等度篩選對(duì)比
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三種pH值條件下，利用等度條件對(duì)三個(gè)HILIC固定相的兩種分析物進(jìn)行篩選。

結(jié)果表明：肌酐在三個(gè)ACE HILIC相中被適當(dāng)?shù)乇Ａ簦捎谶^度保留的原因，肌酸在合理的時(shí)間內(nèi)沒有洗脫。

根據(jù)圖17中的流程圖，過度保留窗口表示梯度（寬時(shí)間段表明梯度方法）可能更適宜。

圖24
ACE HILIC-A相下的Z終方法

ACE HILIC-A在pH3.0下選擇，進(jìn)行梯度分析。

標(biāo)準(zhǔn)梯度在10分鐘內(nèi)析出兩種目標(biāo)分析物，并且解析度很高（分離度很高）（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，這使得梯度時(shí)間進(jìn)一步減少（這種情況下可以使梯度運(yùn)行時(shí)間進(jìn)一步減少），從而縮短了整體運(yùn)行時(shí)間。

Z終方法如圖24中所示。

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動(dòng)相：
A：2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分鐘內(nèi)
流速：1.5 mL/min
檢測(cè)：230 nm
進(jìn)樣：5 μL
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

結(jié)論

HILIC是一種用于多用途的極性分析物色譜分析法（對(duì)于極性化合物來說是一種通用的色譜分析模式）。

這種方法比較復(fù)雜，但如果遵循簡(jiǎn)單規(guī)則，則可實(shí)現(xiàn)可再現(xiàn)的HILIC方法（HILIC方法是可以重現(xiàn)性的）。

三個(gè)ACE HILIC相（固定相）設(shè)計(jì)用于HILIC方法開發(fā)期間研究選擇性，并盡可能快地提供實(shí)現(xiàn)所需分離的選項(xiàng)。

ACE HILIC方法驗(yàn)證協(xié)議（規(guī)程）已成功用于開發(fā)一系列的HILIC方法，應(yīng)為HILIC方法開發(fā)活動(dòng)提供一種結(jié)構(gòu)化的方法。

柱體積為L(zhǎng)C柱內(nèi)被洗脫劑占據(jù)的體積（即粒子之間的空間和粒子孔內(nèi)空間）。

柱體積可根據(jù)以下公式計(jì)算：

Vm=πr2 Lε

其中：

Vm = 柱體積（單位：mL）

 r = 柱半徑（單位：cm）
L = 柱長(zhǎng)度（單位：cm）

ε = 床層空隙度值

床層空隙度值ε取決于粒子參數(shù)（如孔徑、表面積等）和供應(yīng)商。

對(duì)于ACE 100 ?多孔柱，ε值為~0.63；

對(duì)于ACE 300 ?多孔柱，ε值為~0.75；

而對(duì)于ACE 90 ?實(shí)芯柱，ε值為~0.55.
在討論柱平衡時(shí)，更準(zhǔn)確的是引用達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需的柱體積，因?yàn)樗c流速和柱尺寸（規(guī)格）無關(guān)。

例如，表1a示出了一系列ACE 100 ?多孔柱的柱體積值的計(jì)算。  

表 1a：ACE 100 ?多孔柱的體積計(jì)算值（單位：mL）

表2a顯示了各種流速條件下，4個(gè)不同尺寸的ACE 100 ?多孔柱達(dá)到20和60倍柱體積平衡所需的時(shí)間。

表 2a：ACE 100 ?多孔柱平衡計(jì)算

ACE Excel UHPLC色譜柱與所有市售UPLC和UHPLC儀器兼容

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[ACE UltraCore SuperC18色譜柱]人參皂甙分析

Conditions
Column: ACE UltraCore 2.5 SuperC18
Dimensions: 100 x 3.0 mm; 2 x 100 x 3.0 mm (coupled); 3 x 100 x 3.0 mm (coupled)
Part Number: CORE-25A-1003U
Mobile Phase: 

A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in MeCN

Gradient:

Flow Rate: 0.8 mL/min
Injection: 2 μL (100 x 3.0 mm); 4 μL (200 x 3.0 mm); 6 μL (300 x 3.0 mm)
Temperature: 80 °C
Detection: UV, 203 nm
Sample: 5 x 75 mg tablets ground to fine powder and extracted with 10.0 mL MeCN/H2O (1:1 v/v) for 15 minutes with ultrasonication. 100 μL supernatant diluted with 300 μL water and filtered using a Whatman Mini-Uniprep syringeless filter
System: Chromaster Ultra Rs

峰形問題                                   
                                                                         

具有獨(dú)特選擇性的C18 鍵合相：
1.有保證的可重現(xiàn)性
2.的鍵合相穩(wěn)定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

改善色譜分離度
色譜分離的目標(biāo)是在Z短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)組分的足夠分離度（Rs）。

1.5的分離度可以實(shí)現(xiàn)基線分離，然而對(duì)于可以在實(shí)驗(yàn)室之間易于轉(zhuǎn)換的耐用、可重法而言，理想的分離度是1.8-2.0。
分離度方程告訴我們什么變量可以影響分離度：

增加分離度Rs可以通過增加N、α或k來實(shí)現(xiàn)。

然而，如圖1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回報(bào)率快速下降。

例如，Rs僅隨著N平方根的增加而增加。

可以通過增加柱長(zhǎng)或降低柱填充材料的粒徑或兩者的某種組合來增加N。

無論哪種方式，系統(tǒng)背壓隨著N的增加而增加，因此通過增加N實(shí)現(xiàn)令人滿意的分離，其“成本”可能是極高的壓力。
同樣，增加保留值（k值）將會(huì)增加Rs，但回報(bào)率也快速下降。

將k增加至超過10通常是Rs與分析時(shí)間之間的不利權(quán)衡，因?yàn)橹挥蠷s的邊際收益隨著保留時(shí)間的增加而實(shí)現(xiàn)。

該效應(yīng)的圖形表示參見下述圖1。

圖1 N、α和k對(duì)分離度(Rs)的影響
對(duì)于典型的分離，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分離度(Rs)。

然而，從這些圖中可以看出，N或k的提高都會(huì)迅速降低回報(bào)率。
另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個(gè)問題，因此其成為開發(fā)分離方法時(shí)的Z佳優(yōu)化變量。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不會(huì)受回報(bào)率下降的約束。

α的變化對(duì)壓力沒有影響，對(duì)分離時(shí)間的影響也是微乎其微的（參見圖2）。

因此，在開發(fā)分離方法時(shí)，α是Z重要的變數(shù)。

優(yōu)化α可以使您在所有目標(biāo)峰之間達(dá)到滿意的分離度，同時(shí)保持系統(tǒng)背壓和分離時(shí)間在可接受范圍內(nèi)。

改善色譜分離度- 選擇性或柱效？
選擇性(α)由流動(dòng)相、溫度和固定相化學(xué)物質(zhì)控制。大多數(shù)方法開發(fā)策略將探索所有這些色譜變量。
如果使用“標(biāo)準(zhǔn)”3μm C18相沒有達(dá)到足夠的分離度，推薦優(yōu)化分離的色譜選擇性而不是分離柱效，如下述實(shí)例所示。
通過簡(jiǎn)單地將固定相化學(xué)物質(zhì)（即色譜柱）改變?yōu)榫哂刑娲V選擇性的固定相化學(xué)物質(zhì)，易于在標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)上獲得所需分離度，而無需昂貴的UHPLC儀器。

另外，也可以避免復(fù)雜的流動(dòng)相組分、升高的溫度和侵蝕性pH條件。

圖2利用選擇性實(shí)現(xiàn)快速、高分離度的分離

樣品：1）對(duì)乙酰氨基酚2）氫氯噻嗪3）甲基苯基亞砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 溫度：40°C 檢測(cè)：UV, 254 nm 流動(dòng)相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分鐘內(nèi)3- B
比較數(shù)據(jù)不代表所有應(yīng)用。

在保持C18鍵合相的同時(shí)，將粒徑從3μm減小至2μm以下，并不能顯著改善分離效果，另外也會(huì)導(dǎo)致壓力明顯增加。
ACE C18-PFP色譜柱為3個(gè)關(guān)鍵對(duì)提供了更佳的選擇性(α)，因此與2μm以下的C18色譜柱相比，其可以提供的分離效果，即使2μm以下的色譜柱可以提供更高的柱效。
與使用具有高塔板數(shù)和高壓的色譜柱嘗試進(jìn)行峰分離所獲得的結(jié)果相比，利用選擇性的能力可以獲得更佳的分離效果。

PFP分離機(jī)制
ACE C18-PFP相顯示有多個(gè)保留機(jī)制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性。

雖然下述部分提供了相對(duì)強(qiáng)度的近似值，但每個(gè)保留機(jī)制的優(yōu)勢(shì)由溶質(zhì)的物理/化學(xué)性質(zhì)、其結(jié)構(gòu)和所采用的色譜條件決定。

π-π相互作用

PFP環(huán)在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因?yàn)殡娯?fù)性氟原子會(huì)產(chǎn)生缺電子的苯環(huán)，使得PFP相可以作為路易斯酸而起作用。

這將與能夠給出電子的分析物（即路易斯堿）相互作用。
這與苯基相相反，苯基相含有富電子芳香環(huán)（由于不存在吸電子基團(tuán)），因此它們可以作為路易斯堿而起作用。

偶極-偶極和氫鍵

PFP環(huán)中的碳-氟鍵具有強(qiáng)極性。

因此，PFP相可以通過在分析物與電負(fù)性氟原子之間發(fā)生的偶極-偶極或氫鍵相互作用來額外保留分析物。

任何這樣的相互作用將導(dǎo)致保留增加。

形狀選擇性

PFP具有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)與其它可能的保持機(jī)制相結(jié)合時(shí)，可以賦予PFP相優(yōu)異的形狀選擇性。

ACE C18-PFP相顯示有PFP相的多重保留機(jī)制，色譜科學(xué)家們可能會(huì)利用這些機(jī)制來解決在傳統(tǒng)C18相（僅主要依賴于疏水保留機(jī)制）上難以分離（即使并非不可能）的混合物。