ACE色譜柱超惰性固定相對(duì)生物分子反相HPLC的益處

增加PH范圍
大多數(shù)生物分子是帶電荷的。

肽類和蛋白質(zhì)帶有多種電荷。從小分子的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，已流動(dòng)相pH可以成為改變保留值并因此而優(yōu)化帶電化合物分離度的有力工具。

肽類也是如此。

再次以使用血管緊張素II和III作為實(shí)例，下圖顯示在pH=2的條件下，ACE超惰性色譜柱或填充有更具活性固定相的色譜柱上這兩種肽未實(shí)現(xiàn)分離。

通過將pH增加至7，這兩種色譜柱則均能提供良好的分離度。

然而，盡管ACE超惰性色譜柱保持了良好的峰形，但填充低純度硅膠的色譜柱顯示其峰形較差和性能損失。

在極性化合物的許多反相應(yīng)用中觀察到了這種現(xiàn)象。

在中等pH值時(shí)，硅醇相互作用更為普遍，因此峰拖尾在活性固定相上變得更加明顯。

流動(dòng)相pH對(duì)分離度的影響

色譜柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300?
流動(dòng)相：

pH 2 A：0.1% TFA（溶于水中） B: 0.1% TFA（溶于乙腈中）
pH 7 A: 10mM NH4OAc（溶于水中） B: 乙腈 15分鐘內(nèi)25%-40% B
流速：1.0 mL/min

檢測(cè)：UV 215nm
化合物：

1.血管緊張素II
2.血管緊張素III
3.血管緊張素I

調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH是提高選擇性的有力工具。只有基于超純硅膠的色譜柱才能在更高的pH值下保持性能。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE色譜柱超惰性固定相對(duì)生物分子反相HPLC的益處
提高靈敏度
將TFA（三氟乙酸）用作肽類和蛋白質(zhì)反相分離的流動(dòng)相添加劑。
該添加劑通常被用于改善肽類和蛋白質(zhì)復(fù)雜混合物的峰形和分離度。

如下圖所示，在流動(dòng)相中使用0.1％TFA可以使填充有活性固定相的色譜柱產(chǎn)生與由超惰性固定相制備的新一代色譜柱相當(dāng)?shù)姆鍖挕?/p>

然而，隨著TFA濃度降低至0.01％以及Z終的0.005％，超惰性相上的峰寬保持不變，但活性固定相上的峰寬會(huì)發(fā)生變形。
使用極低水平TFA分析肽類和蛋白質(zhì)的能力有利于采用質(zhì)譜法進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)。

TFA可與多肽形成復(fù)合物合并增強(qiáng)選擇性。然而，該相同的復(fù)合作用會(huì)降低質(zhì)譜儀的靈敏度。

用于肽類和蛋白質(zhì)分析的ACE 300?色譜柱

蛋白質(zhì)
條件
色譜柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
溫度：環(huán)境
流動(dòng)相：A. 0.1% TFA（溶于水中） B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），30分鐘內(nèi) 5%-70% B
檢測(cè)：UV, 280nm

化合物
1. 核糖核酸酶A
2. 細(xì)胞色素C
3. 全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白
4. 脫輔基肌紅蛋白

肽類

條件
色譜柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
溫度：環(huán)境
流動(dòng)相：A. 0.1% TFA（溶于水中）B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），25分鐘內(nèi)10%-40% B
檢測(cè)：UV, 220nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催產(chǎn)素
3. 血管緊張素II
4. 神經(jīng)降壓素

靈敏度和峰形，隨TFA的濃度而變化

色譜柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300?
流動(dòng)相：A：TFA（溶于水中） B： 溶于乙腈中的TFA（按照上述說明為％TFA），37.5分鐘內(nèi)10％-55％B。
流速：1.5mL/min
檢測(cè)：UV 200nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催產(chǎn)素
3. 血管緊張素II
4. 神經(jīng)降壓素

隨著TFA濃度的降低，低純度硅膠色譜柱（右圖）顯示性能急劇下降。
由超惰性硅膠制成的色譜柱（如ACE）會(huì)在TFA濃度降低時(shí)保持性能。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE色譜柱超惰性固定相對(duì)生物分子反相HPLC的益處

優(yōu)化選擇性
TFA和其他流動(dòng)相添加劑與肽類和蛋白質(zhì)的復(fù)合能力可用于調(diào)節(jié)選擇性并改善分離度。如下圖所示，將TFA濃度從0.1％降低至0.01％可使血管緊張素II和III實(shí)現(xiàn)分離。

在超惰性ACE色譜柱的情況下，隨著分離度的顯著改善，峰形和靈敏度保持恒定。在Vydac色譜柱（填充有更具活性的固定相）的情況下，峰形被嚴(yán)重破壞。

選擇性，隨TFA的濃度而變化

色譜柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300?
流動(dòng)相：A：TFA（溶于水中）B: 80％TFA（溶于乙腈中），20％TFA（溶于水中），（按照上述說明為％TFA），15分鐘內(nèi)25％-40％B
流速：1.0 mL/min

檢測(cè)：UV 215nm
化合物：

1.血管緊張素II
2.血管緊張素III
3.血管緊張素I

通過降低TFA濃度來(lái)改善分離度。由低品質(zhì)硅膠制成的色譜柱顯示其性能降低。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

市場(chǎng)常見色譜柱惰性比較

• lingxian的3μm、小孔徑C18色譜柱品牌

• 50 x 2.1 mm i.d.LC/MS兼容尺寸

• 堿性分子惰性測(cè)試

• 峰柱效和不對(duì)稱性研究

峰柱效比較  

結(jié)論
當(dāng)分析吡啶（一種高堿性小分子）時(shí)，可以看到柱效、峰形和選擇性的顯著差異。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相上表面的硅醇基之間存在不受歡迎的次級(jí)相互作用。

這些相互作用也可能導(dǎo)致色譜柱可重現(xiàn)性不佳。
之前已對(duì)ACE C18色譜柱進(jìn)行了獨(dú)立測(cè)試，發(fā)現(xiàn)具有出色的柱效和ji致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了這一優(yōu)異性能。

ACE?固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)HPLC分離的不利影響

進(jìn)一步的惰性測(cè)試數(shù)據(jù)包含在ACE HPLC色譜柱目錄中。

此外，還提供了C18柱比較指南，其詳細(xì)介紹了超過50種HPLC色譜柱品牌的材料特性，并將性能與許多測(cè)試探針進(jìn)行了比較。

請(qǐng)聯(lián)系菲羅門索取資料。

ACE? Excel? 色譜柱

ACE Excel 2μm UHPLC色譜柱

• 與所有市售UPLC和UHPLC儀器完全兼容

• 為UHPLC色譜柱提供口碑zhuo越的ACE HPLC色譜柱優(yōu)勢(shì)

• 為UPLC/UHPLC使用者提供了更多選擇的固定相，包括強(qiáng)大的C18-AR和C18-PFP相

• 提供高水平的可靠性和耐用性

• 提供從UHPLC到HPLC再至制備型LC的易擴(kuò)展性

• 適用于UHPLC的2、3和5μm粒徑

制造UHPLC色譜柱是比較困難的，且通常認(rèn)為它們不像HPLC色譜柱那樣耐用和可靠。

憑借其在制造Z優(yōu)質(zhì)HPLC色譜柱方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，Advanced Chromatography Technologies能夠生產(chǎn)出非常可靠的UHPLC色譜柱。

現(xiàn)在，色譜分析師將從UPLC和UHPLC儀器中獲得更多的成果。UPLC和UHPLC使用者利用ACE ExcelUHPLC色譜柱現(xiàn)可以獲得堿性化合物的峰形、改善柱間的可重現(xiàn)性、獲得利用多種分離機(jī)制的附加固定相以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel提供zhuo越的分離度和峰形

條件
流動(dòng)相A = 5mM甲酸（溶于水中）和B = 5mM甲酸（溶液甲醇中）梯度5分鐘內(nèi)3-100％B
流速：0.6 ml/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV, 254 nm
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm

Analytes
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯基砜
5. 阿司匹林

6. 非那西丁
7. 1,3-二硝基苯
8. 1,2,4-三甲氧基苯
9. 苯甲酸乙酯
10. 尼美舒利

11. 布洛芬
12. 吲哚美辛
13. 甲芬那酸

這些比較性色譜圖顯示，C18鍵合相不能將所有13種分析物完全分離。由于其額外的分離機(jī)制，ACE Excel C18-PFP能夠基線分離所有分析物。

備注：比較性分離物不代表所有應(yīng)用。

ACE?是Advanced Chromatography Technologies Limited的注冊(cè)商標(biāo)。
ACE ExcelTM和HSCTM是Advanced Chromatography Technologies Limited的商標(biāo)。
Advanced Chromatography Technologies Limited承認(rèn)Advanced Scientific Instruments、Agilent Technologies Inc.、Alltech AssociatesInc.、GL Sciences Inc.、Idex Health＆Science LLC、Phenomenex Inc.、Shimadzu Corporation、Thermo Fisher Scientific和Waters Corporation的注冊(cè)和未注冊(cè)商標(biāo)，且與上述這些公司沒有任何隸屬關(guān)系。

ACE Excel UHPLC色譜柱與所有市售UPLC和UHPLC儀器兼容

Thermo Scientic Accela

Dionex UltiMate 3000

Waters

• Acquity UPLC

• Acquity UPLC H–Class

• Acquity UPLC I–Class

安捷倫科技

• 1290 Infinity

• 1220 Infinity

• 1260 Infinity
  

• 1200 Infinity

島津

• Nexera

• Prominence

加上許多其他品牌的UHPLC儀器，恕不能一一列舉

具有獨(dú)特選擇性的C18 鍵合相：
1.有保證的可重現(xiàn)性
2.的鍵合相穩(wěn)定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

改善色譜分離度
色譜分離的目標(biāo)是在Z短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)組分的足夠分離度（Rs）。

1.5的分離度可以實(shí)現(xiàn)基線分離，然而對(duì)于可以在實(shí)驗(yàn)室之間易于轉(zhuǎn)換的耐用、可重法而言，理想的分離度是1.8-2.0。
分離度方程告訴我們什么變量可以影響分離度：

增加分離度Rs可以通過增加N、α或k來(lái)實(shí)現(xiàn)。

然而，如圖1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回報(bào)率快速下降。

例如，Rs僅隨著N平方根的增加而增加。

可以通過增加柱長(zhǎng)或降低柱填充材料的粒徑或兩者的某種組合來(lái)增加N。

無(wú)論哪種方式，系統(tǒng)背壓隨著N的增加而增加，因此通過增加N實(shí)現(xiàn)令人滿意的分離，其“成本”可能是極高的壓力。
同樣，增加保留值（k值）將會(huì)增加Rs，但回報(bào)率也快速下降。

將k增加至超過10通常是Rs與分析時(shí)間之間的不利權(quán)衡，因?yàn)橹挥蠷s的邊際收益隨著保留時(shí)間的增加而實(shí)現(xiàn)。

該效應(yīng)的圖形表示參見下述圖1。

圖1 N、α和k對(duì)分離度(Rs)的影響
對(duì)于典型的分離，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分離度(Rs)。

然而，從這些圖中可以看出，N或k的提高都會(huì)迅速降低回報(bào)率。
另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個(gè)問題，因此其成為開發(fā)分離方法時(shí)的Z佳優(yōu)化變量。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不會(huì)受回報(bào)率下降的約束。

α的變化對(duì)壓力沒有影響，對(duì)分離時(shí)間的影響也是微乎其微的（參見圖2）。

因此，在開發(fā)分離方法時(shí)，α是Z重要的變數(shù)。

優(yōu)化α可以使您在所有目標(biāo)峰之間達(dá)到滿意的分離度，同時(shí)保持系統(tǒng)背壓和分離時(shí)間在可接受范圍內(nèi)。

改善色譜分離度- 選擇性或柱效？
選擇性(α)由流動(dòng)相、溫度和固定相化學(xué)物質(zhì)控制。大多數(shù)方法開發(fā)策略將探索所有這些色譜變量。
如果使用“標(biāo)準(zhǔn)”3μm C18相沒有達(dá)到足夠的分離度，推薦優(yōu)化分離的色譜選擇性而不是分離柱效，如下述實(shí)例所示。
通過簡(jiǎn)單地將固定相化學(xué)物質(zhì)（即色譜柱）改變?yōu)榫哂刑娲V選擇性的固定相化學(xué)物質(zhì)，易于在標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)上獲得所需分離度，而無(wú)需昂貴的UHPLC儀器。

另外，也可以避免復(fù)雜的流動(dòng)相組分、升高的溫度和侵蝕性pH條件。

圖2利用選擇性實(shí)現(xiàn)快速、高分離度的分離

樣品：1）對(duì)乙酰氨基酚2）氫氯噻嗪3）甲基苯基亞砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 溫度：40°C 檢測(cè)：UV, 254 nm 流動(dòng)相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分鐘內(nèi)3- B
比較數(shù)據(jù)不代表所有應(yīng)用。

在保持C18鍵合相的同時(shí)，將粒徑從3μm減小至2μm以下，并不能顯著改善分離效果，另外也會(huì)導(dǎo)致壓力明顯增加。
ACE C18-PFP色譜柱為3個(gè)關(guān)鍵對(duì)提供了更佳的選擇性(α)，因此與2μm以下的C18色譜柱相比，其可以提供的分離效果，即使2μm以下的色譜柱可以提供更高的柱效。
與使用具有高塔板數(shù)和高壓的色譜柱嘗試進(jìn)行峰分離所獲得的結(jié)果相比，利用選擇性的能力可以獲得更佳的分離效果。

PFP分離機(jī)制
ACE C18-PFP相顯示有多個(gè)保留機(jī)制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性。

雖然下述部分提供了相對(duì)強(qiáng)度的近似值，但每個(gè)保留機(jī)制的優(yōu)勢(shì)由溶質(zhì)的物理/化學(xué)性質(zhì)、其結(jié)構(gòu)和所采用的色譜條件決定。

π-π相互作用

PFP環(huán)在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因?yàn)殡娯?fù)性氟原子會(huì)產(chǎn)生缺電子的苯環(huán)，使得PFP相可以作為路易斯酸而起作用。

這將與能夠給出電子的分析物（即路易斯堿）相互作用。
這與苯基相相反，苯基相含有富電子芳香環(huán)（由于不存在吸電子基團(tuán)），因此它們可以作為路易斯堿而起作用。

偶極-偶極和氫鍵

PFP環(huán)中的碳-氟鍵具有強(qiáng)極性。

因此，PFP相可以通過在分析物與電負(fù)性氟原子之間發(fā)生的偶極-偶極或氫鍵相互作用來(lái)額外保留分析物。

任何這樣的相互作用將導(dǎo)致保留增加。

形狀選擇性

PFP具有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)與其它可能的保持機(jī)制相結(jié)合時(shí)，可以賦予PFP相優(yōu)異的形狀選擇性。

ACE C18-PFP相顯示有PFP相的多重保留機(jī)制，色譜科學(xué)家們可能會(huì)利用這些機(jī)制來(lái)解決在傳統(tǒng)C18相（僅主要依賴于疏水保留機(jī)制）上難以分離（即使并非不可能）的混合物。

色譜柱ACE