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  CH68453622 2017-05-11 00:00:00

  為什么高濃度的dntp對擴增YZ 標準的PCR反應(yīng)體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。 設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCZ好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 ⑤引物3’端的堿基，特別是Z末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列Z好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 ⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

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