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  李金桂lxkc 2016-05-31 02:58:44

  研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法 一、引言 在許多的細胞生命活動中，例如DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問題。 重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們已分離到了許多重要的基因?，F(xiàn)在的關(guān)鍵問題是需要揭示環(huán)境因子及發(fā)育信號究竟是如何控制基因的轉(zhuǎn)錄活性。為此需要： a、鑒定分析參與基因表達調(diào)控的DNA元件； b、分離并鑒定這些順式元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子； 這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法主要包括： a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗； c、甲基化干擾實驗； d、體內(nèi)足跡實驗； f、拉下實驗。 二、凝膠阻滯實驗 1、概念： 凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay），要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。 2、原理： 在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數(shù)成反比。如果某種DNA分子結(jié)合上一種特殊的蛋白質(zhì)，那么由于分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，于是朝正極移動的距離也就相應(yīng)的縮短，因而在凝膠中出現(xiàn)滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實驗的基本原理。 3、過程: 1) 首先制備細胞蛋白質(zhì)提取物（理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子） 2) 用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點） 3) 這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質(zhì)提取物一起進行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物 4) 在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 5) Z后進行放射自顯影，分析電泳結(jié)果 4、實驗結(jié)果的分析： a、如果有放射性標記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)； b、如果在凝膠的頂部出現(xiàn)放射性標記的條帶，這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)。 5、DNA競爭實驗： DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下： 在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA），如果它同探針DNA結(jié)合的是同一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)都會被競爭結(jié)合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結(jié)合狀態(tài)，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現(xiàn)阻滯的條帶； 如果反應(yīng)體系中加入的競爭DNA并不能同探針DNA競爭結(jié)合同一種轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現(xiàn)阻滯的條帶。 6、應(yīng)用： a、凝膠阻滯實驗可以用于鑒定在特殊類型細胞蛋白質(zhì)提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)； b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合的精確序列部位； c、通過競爭DNA中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的堿基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響； d、也可以利用DNA同特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用通過親和層析來分離特定的轉(zhuǎn)錄因子。 三、足跡實驗 1、定義: 足跡實驗（foot-printing assay），是一種用來檢測被特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結(jié)構(gòu)的專門實驗方法。 2、原理： 當DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個空白區(qū)，俗稱為“足跡”。 3過程： 將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5‘末端標記，并用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切出其中的一個末端，于是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA 在體外同細胞蛋白質(zhì)提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體 在反應(yīng)混合物中加入少量的DNase I，并控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂： a、如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使DNase I消化之后，便會產(chǎn)生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸------等等一系列前后長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續(xù)的DNA片段梯度群體； b、如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用； 除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組: a、實驗組：DNA+蛋白質(zhì)混合物 b、對照組：只有DNA，未與蛋白質(zhì)提取物進行溫育 Z后進行放射性自顯影，分析實驗結(jié)果。 4、結(jié)果判斷: 實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現(xiàn)空白的區(qū)域表明是轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質(zhì)結(jié)合部位的DNA區(qū)段相應(yīng)的核苷酸序列。 5、其他的足跡實驗方法： 除了DNase1足跡試驗之外，目前還發(fā)展出了若干種其他類型的足跡實驗，例如： a、 自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗 DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理 DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割。如果DNA分子中某一區(qū)段同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就可以避免發(fā)生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。 四、甲基化干擾實驗 1、概念： 甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割這一原理設(shè)計的另一種研究蛋白質(zhì)同DNA相互作用的實驗方法。 應(yīng)用這種技術(shù)可以檢測靶DNA中G殘基的優(yōu)先甲基化，對爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會有什么效應(yīng)，從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質(zhì)相互作用的模式。 2、實驗步驟： 用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發(fā)生一個G堿基甲基化作用） 同細胞蛋白質(zhì)提取物一起進行溫育，促進使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合 進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶： a、 其一沒有同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA正常電泳條帶 b、其二同特異蛋白質(zhì)結(jié)合而呈現(xiàn)滯后的DNA電泳條帶 將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，并用六氫吡啶進行切割，結(jié)果為： a、甲基化的G殘基被切割:因為轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)只能夠同未發(fā)生甲基化的正常的結(jié)合位點結(jié)合，所以在轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之后，轉(zhuǎn)錄因子就無法同其結(jié)合位點（順式元件）發(fā)生結(jié)合作用，從而使得結(jié)合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割； b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割 將結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶和不結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶，經(jīng)六氫吡啶切割作用之后，再進行凝膠電泳 作放射自顯影，讀片并分析結(jié)果 3、結(jié)果判斷： a、同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶DNA序列，經(jīng)六氫吡啶切割之后，電泳分離呈現(xiàn)兩條帶，有一個空白區(qū) b、不同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶DNA序列，經(jīng)六氫吡啶切割后，電泳分離呈現(xiàn)三條帶，沒有空白區(qū)域的出現(xiàn)。 4、應(yīng)用： a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點中的G殘基之間的聯(lián)系； b、是足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置 5、缺點： DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。 五、體內(nèi)足跡實驗 上面討論的三種研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用的方法，有一個共同的不足之處在于它們是在體外進行的實驗，因此人們就會考慮這些實驗結(jié)果是否能夠反映細胞內(nèi)發(fā)生的真實生命過程，即細胞內(nèi)發(fā)生的真實的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用情況。 為了解答這個問題，科學(xué)家就設(shè)計出了一種體內(nèi)足跡試驗（in vivo foot-printing assay），該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種。 1、原理： 體內(nèi)足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質(zhì)差別，即 a、DMS能夠使G殘基甲基化； b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基； c、同特異轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的識別序列中的G殘基由于受到蛋白質(zhì)的保護而不會被DMS甲基化，于是不會被六氫吡啶切割； d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會發(fā)現(xiàn)活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應(yīng)條帶。 2、過程： 用有限數(shù)量的化學(xué)試劑DMS處理完整的游離細胞，使?jié)B透到胞內(nèi)的DMS濃度恰好導(dǎo)致天然染色體DNA的G殘基發(fā)生甲基化 對這些經(jīng)過DMS處理的細胞提取DNA，并在體外加入六氫吡啶作消化反應(yīng) PCR擴增后作凝膠電泳分析，因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數(shù)量足夠，而在體內(nèi)足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA，其數(shù)量是微不足道的，所以需要經(jīng)PCR擴增以獲得足夠數(shù)量的特異DNA 放射自顯影，讀片并記錄讀片的結(jié)果 3、結(jié)果判斷： a、能夠同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用； b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割。 六、拉下實驗（Pull-down assay） 拉下實驗又叫做蛋白質(zhì)體外結(jié)合實驗（binding assay in vitro），是一種在試管中檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達為融合蛋白。分離純化融合蛋白并與磁珠結(jié)合，使之固相化之后，再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間，例如在4℃下保溫過夜，使目標蛋白同已經(jīng)固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結(jié)合。離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結(jié)合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結(jié)合的目的蛋白，經(jīng)過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來，收集樣品，再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析，以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白。 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP） 　　真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay， CHIP）是目前唯yi研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進一步完善，它必將會在基因表達調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。 　　染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，也稱結(jié)合位點分析法，在過去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項技術(shù)幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。近年來，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管疾病以及ZY神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。 　　它的原理是在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時，通過運用對應(yīng)于一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來。IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“prorein A”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。實驗Z需要注意點就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每YZ劑，低溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。 　　ChIP的一般流程： 　　甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀---對沉淀下來的復(fù)合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。 　　在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，Z后分析的時候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來準備樣品）。 GST沉淀實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質(zhì)相互作用）5-11 上面提到，用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定。鑒定方法之一就是 GST 沉淀實驗。GST 沉淀實驗主要是用來證明蛋白質(zhì)胞外的相互作用。蛋白質(zhì)在胞外的相互作用排除了酵母細胞內(nèi)復(fù)雜體系的干擾，，比較直接地檢驗蛋白質(zhì)分子之間存在的物理的相互作用。同酵母雙雜交實驗一樣，運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調(diào)節(jié)作用的結(jié)構(gòu)域或 motif。GST 沉淀實驗原理就是，把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）基因的原核表達載體中，并在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）。把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上，然后把另一種蛋（Y）白加入其中。由于蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用，形成了這樣的復(fù)合物：GST-X----Y。這一復(fù)合物與固體支持物（Sepharose beads）又 結(jié)合在一起，可以被沉淀下來。此法又有在不同情況下的具體應(yīng)用，以下一一作介紹。 （1） GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用 GST 融合蛋白是在原核表達的，所以沒有經(jīng)過過多的象真核細胞內(nèi)具有的蛋白修飾作用。 所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來，也就是所謂的重組蛋白。當 GST融合蛋白把重組蛋白沉淀下來，然后用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測。 （2） GST 融合蛋白與體外 系統(tǒng)合成的多肽或蛋白的相互作用 用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用體外蛋白合成體系進行合 成，并且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于檢測的標簽。GST融合蛋白沉淀下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測。如果蛋白之間結(jié)合力非常弱，用Western blotting檢測方法難以檢測到，你可以在體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記。這樣沉淀下來的蛋白進行放射自顯影，檢測靈敏度將極大提高。 （3） GST 融合蛋白與細胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)的相互作用 GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內(nèi)源性蛋白質(zhì)沉淀下來。如果內(nèi)源性蛋 白含量低或結(jié)合力弱，可以采用脈沖法使細胞在某一段時間內(nèi)合成的所有蛋白質(zhì)都標記上放射性同位素（S32），然后提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育。GST融合蛋白沉淀下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳，進行放射自顯影。 （4） GST 融合蛋白與細胞內(nèi)瞬時表達的蛋白質(zhì)的相互作用 當內(nèi)源性蛋白質(zhì)含量低，并且有可能影響蛋白質(zhì)的相互作用，也可以把該蛋白的基因轉(zhuǎn)染 到靶細胞內(nèi)進行過表達，然后檢驗蛋白質(zhì)相互作用。 （5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態(tài)有關(guān)在進行 GST 沉淀實驗時，有時也會遇到比較復(fù)雜的情況，具體情況具體分析，分別對待。比如，兩個蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態(tài)有關(guān)。或者蛋白首先被磷酸化后方能產(chǎn)生相互作用，或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化后才能產(chǎn)生相互作用。如果你確實在你 的實驗中發(fā)現(xiàn)了其中一種情況，這將是一個非常有意義的結(jié)果。 3， 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ）（細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用）9-16 免疫共沉淀技術(shù)用來證明蛋白質(zhì)在胞內(nèi)是否有相互作用。一般來說，兩種蛋白在細胞內(nèi)發(fā) 生相互作用時會形成兩種蛋白的復(fù)合物，這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復(fù)合物沉淀下來，然后用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測，看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復(fù)合物，并能與 protein A/G agarose 一起沉淀下來。免疫共沉淀原理簡單，但技術(shù)極為復(fù)雜。因為細胞內(nèi)蛋白種類繁多，制約因素多。如果兩種蛋白之間可以發(fā)生相互作用，并不是這兩種蛋白所有分子都參與結(jié)合作用，也可能只有極少部分蛋白分子結(jié)合在一起（足以滿足細胞功能需要）。在提取細胞蛋白時，如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性，使得免疫共沉淀實驗失敗。如果兩種蛋白在細胞內(nèi)的結(jié)合力確實非常弱，那么免疫共沉淀也難以成功。如果知道發(fā)生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白，那么可以通過提取核蛋白，再進行免疫共沉淀實驗，這樣會大大減低背景的干擾。關(guān)于兩種蛋白質(zhì)之間胞內(nèi)的相互作用，有時確實無法用免疫共沉淀實驗證明。 （1） 細胞內(nèi)過表達蛋白的免疫共沉淀 證明蛋白質(zhì)胞內(nèi)相互作用時，可以選擇一個GX瞬時過表達系統(tǒng)（至于這一系統(tǒng)是否有內(nèi) 源性靶蛋白無關(guān)緊要）。一般采取 COS 細胞作為真核表達株。把兩種蛋白基因共轉(zhuǎn)染到 COS 細胞內(nèi)進行表達。由于人為進行大量表達，所以在胞內(nèi)兩種蛋白形成相互作用的復(fù)合物的量也相應(yīng)增多。如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體，可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達，然后用商業(yè)化的抗標簽抗體進行免疫共沉淀和 Western blotting 檢測。 （2） 細胞內(nèi)源性蛋白的免疫共沉淀 把兩種蛋白共轉(zhuǎn)染到 COS 細胞內(nèi)進行過表達，進行免疫共沉淀實驗，相對容易成功，但是 這一結(jié)果畢竟具有人工性，不能代表生理條件下真實的蛋白質(zhì)相互作用。要想克服這一弱點， 可以做內(nèi)源性的免疫共沉淀實驗。這一技術(shù)要求極高，難度極大，但也Z有說服力。因為細胞內(nèi)內(nèi)源性蛋白含量低，結(jié)合在一起形成復(fù)合物的量更低，難以檢測。首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內(nèi)源性的蛋白。另外，用于免疫沉淀和 Western blotting 檢測的抗體要好。細胞裂解、收集以及免疫沉淀時時條件要溫和，以保持蛋白復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)。 （3） 組織內(nèi)蛋白的免疫共沉淀 在體外可以大量培養(yǎng)細胞，然后制備細胞提取物，做內(nèi)源性免疫共沉淀。由此可以推廣到做 組織內(nèi)免疫共沉淀。取動物組織（腦、肝、脾等），切碎，勻漿，提取組織蛋白，進行免疫共沉淀實驗。這一結(jié)果代表活體中蛋白質(zhì)相互作用。 4， 蛋白質(zhì)細胞內(nèi)定位實驗17-22 另一種經(jīng)常用來檢驗蛋白質(zhì)相互作用的方法是蛋白質(zhì)細胞內(nèi)定位技術(shù)。此法較為直觀，可 以看到兩種有相互作用的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內(nèi)共定位等等）。有時相互作用的蛋白由于細胞內(nèi)某種功能的需要結(jié)合在一起時，使得兩種蛋白的分布發(fā)生變化。比如，某種蛋白也許在核內(nèi)，當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結(jié)合時，有可能被轉(zhuǎn)運到胞漿中。這種情況的共定位則較為典型。在進行蛋白質(zhì)共定位 （1） 利用有色熒光蛋白標記技術(shù)進行蛋白定位研究 此法也可稱為活細胞定位。把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光 蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中，共轉(zhuǎn)染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白。這樣，相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光，可以在細胞內(nèi)用熒光顯微鏡直接觀測。在進行精確細胞定位或共定位時，必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測。因為共聚焦熒光顯微鏡（相當于醫(yī)院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內(nèi)一個切面上的顏色。如果在一個切面上在同一區(qū)域看到兩種顏色，就提示這兩種蛋白在該區(qū)域內(nèi)有相互作用。普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象，無法確定蛋白質(zhì)共定位現(xiàn)象。在進行定位或共定位同時，也可以對細胞核進行染色。這樣，在細胞中就有三種顏色。細胞核的顯色幫助你確定共定位發(fā)生的位置。上面介紹的活細胞定位，其優(yōu)點是表達的熒光蛋白熒光強，沒有背景，觀測方便。但缺點 是相互作用的蛋白由于標上熒光蛋白，實際上是兩個融合蛋白。融合蛋白的定位結(jié)果或共定位結(jié)果是否與天然蛋白分布一致，有待于進一步確定。而利用免疫熒光標記技術(shù)可以避免這一缺點。 （2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術(shù)進行蛋白定位研究 免疫熒光的原理是，首先把細胞進行固定，然后用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內(nèi) 靶蛋白進行免疫反應(yīng)，再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應(yīng)。這樣就在細胞內(nèi)形成免疫復(fù)合物（靶蛋白----一抗---二抗），結(jié)果靶蛋白被標上顏色，然后可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結(jié)果。 免疫熒光技術(shù)Z大優(yōu)點就是可用來檢測細胞內(nèi)源性蛋白的定位及相互作用。當然也可以對 靶細胞進行轉(zhuǎn)染表達目的蛋白，然后標記目的蛋白進行觀測。免疫熒光技術(shù)的缺點是熒光相對較弱并且背景較高，結(jié)果受到干擾，所以這項技術(shù)不好掌握。為了結(jié)果的可靠性，要求嚴格設(shè)計陽性對照與陰性對照。 （3） 細胞內(nèi)蛋白動態(tài)定位 有時細胞在正常狀態(tài)下，有相互作用的蛋白在胞內(nèi)可能暫時分開，沒有共定位現(xiàn)象發(fā)生。 但是在某一個特定情況下，如細胞受到外界刺激時，細胞本身會產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)，這時暫時分離的蛋白有可能發(fā)生相互作用，并產(chǎn)生共定位現(xiàn)象。所以在進行共定位研究時，可根據(jù)具體情況具體分析，必要時觀測細胞內(nèi)蛋白動態(tài)定位結(jié)果。

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