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  沙漠之鵠 2017-03-19 00:00:00

  PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR是一種體外DNA 擴增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。 PCR擴增儀 在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于—個復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個數(shù)量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。PCR技術(shù)常與其他技術(shù)結(jié)合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。 類別 聽語音 競爭性PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。 將PCR技術(shù)和限制酶切技術(shù)結(jié)合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR擴增產(chǎn)物，通過對酶切產(chǎn)物的分析，探測該基因的多態(tài)性。 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA， RAPD)也是應(yīng)用比較廣泛的一項技術(shù)。RAPD是用那些對某—特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應(yīng)器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內(nèi)微生物種群的變化以及比較小試規(guī)模和中試規(guī)模的反應(yīng)器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。 步驟 聽語音 PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性 模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引 物的退火(復(fù)性) 模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； 引物的延伸 DNA模板--引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

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