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  歡樂男孩紙 2008-09-19 00:00:00

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  李李劉碩 2017-11-26 12:17:07

  　　實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng) 　　1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 　　初步掌握哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的基本操作過程，為生物工程在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 　　2.實(shí)驗(yàn)原理 　　從生物體中取出某種組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，在人工培養(yǎng)條件下使其生存、生長、繁殖或傳代，這一過程稱為細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的Z大優(yōu)點(diǎn)是使我們得以直接觀察活細(xì)胞，并在有控制的環(huán)境條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)的許多復(fù)雜因素，還可以與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)互為補(bǔ)充，可同時(shí)提供大量生物性狀相同的細(xì)胞作為研究對(duì)象，耗費(fèi)少，比較經(jīng)濟(jì)，因此成為生物學(xué)研究的重要手段。近年來，在體細(xì)胞遺傳、分化、胚胎發(fā)生、腫瘤發(fā)生、免疫學(xué)、細(xì)胞工程、放射生物學(xué)以及老年學(xué)等一系列的研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用，并取得了豐碩的成果。 　　細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代(繼代)培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行首次培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。 　　細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜、要求條件多而嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)性工作。所有離體細(xì)胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機(jī)鹽影響，消毒、配液等均有嚴(yán)格的規(guī)范和要求，特別是無菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。 　　3.實(shí)驗(yàn)用品 　　3.1 材料和標(biāo)本 乳兔、HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞) 　　3.2 器材和儀器 手術(shù)器械、平皿、培養(yǎng)瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。 　　2.3 試劑 含有5％小牛血清的MEM培養(yǎng)液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。 　　4.實(shí)驗(yàn)方法 　　4.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 　　4.1.1 原理 　　細(xì)胞培養(yǎng)(Cell culture)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程等領(lǐng)域，發(fā)展成一種重要生物技術(shù)，并取得顯著成就。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。 　　4.1.2 操作 　?、伲〔? 　　用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個(gè)動(dòng)物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。 　?、冢懈? 　　用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。 　?、郏?、接種培養(yǎng) 　　吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動(dòng)一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入二個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 　　4.1.3 結(jié)果 　　細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。 　　4.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng) 　　4.2.1 原理 　　體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。 　　細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增3～6次。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個(gè)階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。 　　常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)／100個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％。細(xì)胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力Z好時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長期)，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)。 　　4.2.2 操作 　?、伲畬㈤L成單層的原代培養(yǎng)細(xì)胞或HeLa細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺(tái)中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置5～10分鐘。 　?、?在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變園，相互之間不再連接成片，這時(shí)應(yīng)立即 　　在超凈臺(tái)中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。 　?、郏畬⒓?xì)胞懸液吸出2ml左右，加到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中并向每個(gè)瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。 　　4.2.3 結(jié)果 　　一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。 　　4.3 器材及液體的準(zhǔn)備和無菌操作的注意事項(xiàng) 　　4.3.1 器材和液體的準(zhǔn)備 　　細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材，如：培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時(shí)干烤滅菌后備用；手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用。 　　4.3.2 無菌操作中的注意事項(xiàng) 　　在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔。為此，在操作前要認(rèn)真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動(dòng)超凈臺(tái)吹風(fēng)。操作時(shí)，嚴(yán)禁說話，嚴(yán)禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺(tái)內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺(tái)內(nèi)完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺(tái)外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體?？傊?，在整個(gè)無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行。 　　5．實(shí)驗(yàn)報(bào)告 　　(1).原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)有哪些區(qū)別? 　　(2).總結(jié)一下你自己的經(jīng)驗(yàn)，怎樣才能既迅速，又保證無菌操作。

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