概述

寡核苷酸是一類只有50個(gè)以下堿基的短鏈核苷酸的總稱（包括脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。

近幾年，隨著寡核苷酸療法在ZL各種疾病適應(yīng)癥方面取得了臨床上顯著的進(jìn)展，已有多種寡核苷酸類藥物，如小干擾RNA (siRNA) 和反義寡核苷酸 (ASO) 藥物獲得了FDA上市批準(zhǔn)。另外還有多種microRNA (miRNA) 和適配體 (Aptamer) 正在研發(fā)中。因此，更大量、更高純度的寡核苷酸產(chǎn)品的需求也隨之日益增長。

東曹生命科學(xué)提供多種具有高分辨率、選擇性的色譜柱和層析填料產(chǎn)品以滿足從分析到純化制備不同規(guī)模的應(yīng)用需求。

寡核苷酸的HPLC分離模式

下表中列舉了寡核苷酸HPLC分析的幾種分離模式及適用的分離條件。也可以通過連用MS進(jìn)行檢測(cè)。

ZL性寡核苷酸是由固相化學(xué)合成法制成。在合成過程中會(huì)產(chǎn)生工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包含許多目標(biāo)產(chǎn)物的類似物（分子量的差別：堿基數(shù)n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不對(duì)稱化合物、異構(gòu)體等。因此，雜質(zhì)的分析監(jiān)控對(duì)工藝和質(zhì)量控制就顯得十分重要。一般而言，通過陰離子交換色譜法即可實(shí)現(xiàn)這一分析需求。

寡核苷酸IEC-HPLC分析

下圖是使用TSKgel DNA-STAT陽離子交換色譜柱分離具有不同序列的4種寡核苷酸引物 (單鏈) 。

在IEC分離模式中，如果使用無孔填料的色譜柱可以提高分辨率。此款色譜柱采用的是親水性無孔樹脂填料，粒徑5μm，表面由開放型多層陰離子交換基團(tuán)構(gòu)成。這些特性與創(chuàng)新的化學(xué)鍵合方法相結(jié)合，使其載量更高、操作壓力更低，非常適合于寡核苷酸的高分辨率分析。

寡核苷酸的純度檢測(cè)

在離子交換色譜柱中，可以對(duì)離子基團(tuán)與主成分有一處不同的化合物進(jìn)行分離，比如能夠分離n-1、n、n+1的化合物。下圖是TSKgel DNA-NPR陽離子交換色譜柱對(duì)13個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸粗樣分析的色譜圖。

TSKgel DNA-STAT色譜柱對(duì)粗制的寡核苷酸與純化后的樣品進(jìn)行純度評(píng)估。

寡核苷酸的分析要點(diǎn)

1、根據(jù)核酸樣品的穩(wěn)定性和大小來選擇合適的洗脫液。如果核酸的穩(wěn)定性很高，可以采用堿性溶液 (NaOH，pH12) 和高溫60℃條件下分離，可提高分辨率。如果是穩(wěn)定性差的，則推薦使用pH7-8的中性洗脫液，溫度40℃條件下分離。

2、在樣品吸附強(qiáng)的情況下，可使用比NaCl或NaBr洗脫能力更強(qiáng)的NaClO₄進(jìn)行梯度分離。

3、如果樣品是超巨大雙鏈DNA (如質(zhì)粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的話不僅可以獲得高分辨率，而且回收率也會(huì)更好。

上篇文章《寡核苷酸類藥物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色譜柱應(yīng)用例》中我們提到了隨著寡核苷酸藥物的研發(fā)步伐越來越快，對(duì)高純度寡核苷酸產(chǎn)品的需求也日趨旺盛。目前，寡核苷酸主要是通過化學(xué)合成法制成，在合成過程中會(huì)產(chǎn)生工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，離子交換液相色譜法是分析這些雜質(zhì)的重要手段之一。此篇文章我們將介紹尺寸排阻色譜法在寡核苷酸藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分離模式是基于堿基數(shù)量、磷酸基不同導(dǎo)致的分子量差別進(jìn)行分離，通常用于簡(jiǎn)單的質(zhì)量控制或純度研究。該模式的優(yōu)點(diǎn)是可以使用接近生理?xiàng)l件的洗脫溶液進(jìn)行等度分離。有時(shí)也會(huì)添加水溶性有機(jī)溶劑來YZ疏水吸附。

分析不同堿基數(shù)目的寡核苷酸

下圖是采用兩根串聯(lián)的SEC色譜柱TSKgel UP-SW2000來區(qū)分長度相差一個(gè)堿基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

TSKgel UP-SW2000是東曹生命科學(xué)ZX開發(fā)的粒徑2μm、孔徑12.5nm的硅膠基質(zhì)SEC色譜柱，主要用于分離分子量范圍為1-150kDa的小蛋白、肽和寡核苷酸等生物分子。該色譜柱兼容HPLC和UHPLC系統(tǒng)，因此也能夠從傳統(tǒng)的HPLC-SEC方法轉(zhuǎn)換到UHPLC。

下圖是使用TSKgel G2000SWXL色譜柱分離不同堿基數(shù)量的合成寡核苷酸混合物的譜圖。為了YZ核酸酶活性，有時(shí)會(huì)在流動(dòng)相中添加EDTA等約1 mmol/L的螯合劑。

SEC法分離脂質(zhì)體包被的siRNA

下圖是使用TSKgel SuperSW2000色譜柱對(duì)天然型DNA核酸藥物Defitelio進(jìn)行質(zhì)量分析的示例。

參考文獻(xiàn)：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

寡核苷酸分析用SEC色譜柱

下表中列出了適用于核酸分離的SEC色譜柱。對(duì)于＜375 bp的短鏈核酸或寡核苷酸，UP-SW3000、UP-SW2000、G3000SWXL以及G2000SWXL這幾款色譜柱都是比較推薦的。

甜菜堿（Betaine）是一種生物堿，天然存在于很多動(dòng)植物體內(nèi)。其分子內(nèi)有3個(gè)有效甲基，作為甲基提供者參與合成蛋氨酸，在營養(yǎng)物質(zhì)的代謝中起著十分重要的作用。甜菜堿在醫(yī)藥、化妝品、食品發(fā)酵和飼料工業(yè)等多個(gè)行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用。

本應(yīng)用參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2947-2016，按GX液相色譜法，采用親水作用多孔硅膠色譜柱TSKgel Amide-80 (3 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm) 來測(cè)定甜菜堿的含量。分析結(jié)果表明，該色譜柱完全滿足標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)甜菜堿分離檢測(cè)的要求。

溶液配制

樣品稀釋液：75% 乙腈-水溶液。

用樣品稀釋液將甜菜堿儲(chǔ)備液 (2 mg/mL) 序列稀釋得到濃度為0 μg/mL，20 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL，2000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次由低到高進(jìn)樣檢測(cè)。

分析條件

色譜柱：TSKgel Amide-80 (3μm, 4.6mmI.D. ×15cm)

流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫

流速：1.0 mL/min

柱溫：30℃

紫外檢測(cè)器：205 nm

進(jìn)樣量：10 μL

流動(dòng)相梯度洗脫程序見下表：

分析結(jié)果

圖1.  甜菜堿2000 μg/mL檢測(cè)圖譜

圖2.  甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)方差=0.99997）

        大家都知道HPLC色譜柱的壽命是有限的，在使用過程中隨著時(shí)間的推移，其性能開始下降。你可以通過峰形和峰形之間的分離，柱背壓的不規(guī)律增加以及重影峰的出現(xiàn)來判斷HPLC色譜柱的性能出現(xiàn)了下降。色譜柱是昂貴的色譜耗材，平常使用完畢后需要保養(yǎng)。如果色譜柱真的發(fā)生了性能下降，有什么方法可以恢復(fù)呢?

        首先，如果色譜柱由于過載或使用不兼容的流動(dòng)相而結(jié)垢，是可以恢復(fù)的，但已經(jīng)損壞的色譜柱或已經(jīng)過使用壽命的色譜柱無法恢復(fù)，需要更換。

        色譜柱還原程序如下，供大家參考：

        反相柱

        反相分離是大多數(shù)HPLC分離中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相組成。建議以水-乙腈-異丙醇-庚烷-異丙醇-乙腈-流動(dòng)相的順序用10至20倍體積的溶劑洗脫

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍體積的溶劑沖洗，按照庚烷-異丙醇-乙腈-

       水-異丙醇-庚烷的順序。

        GPC / GFC色譜柱

        用5倍體 積且PH值為3的0.1%磷酸鹽緩沖液沖洗。如果使用了保留力強(qiáng)的蛋白質(zhì)，則使用從水到乙腈再到水的60分鐘梯度液沖洗。

        色譜柱在使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是zui佳條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。

        恒譜生色譜柱柱管由不銹鋼制成，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光，減小管壁效應(yīng)，提高柱效，柱中填充鍵合硅膠或聚合物填料。色譜柱基于高純硅膠，采用獨(dú)特鍵合技術(shù)，具有優(yōu)異的峰形，靈敏性好。基質(zhì)金屬含量低，對(duì)所有類型的分析物均表現(xiàn)完好峰形。機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，質(zhì)控嚴(yán)格，確保色譜柱性能和色譜柱的使用壽命。有多種尺寸規(guī)格可供選擇以適應(yīng)色譜工作者及其使用的不同需求。我們有專業(yè)的技術(shù)工程師團(tuán)隊(duì)為您的需求提供解決方案，歡迎前來咨詢了解！

GX液相色譜柱是消耗品，會(huì)隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，出現(xiàn)柱效下降無法達(dá)到分離要求，或伴有峰型拖尾、分叉等情況。需要定期進(jìn)行清洗和再生，以保證色譜柱的柱效和使用壽命。

不同類型的色譜柱都有與之對(duì)應(yīng)的清洗方法。本文為大家介紹TSKgel SW系列硅膠尺寸排阻色譜柱的清洗方法。

根據(jù)樣品性質(zhì)，建議先從以下①和②中選擇適當(dāng)?shù)那逑捶椒?，每一步清洗之間用純水沖洗。清洗色譜柱時(shí)的流速與溶劑替換流速一致。

1 去除離子性雜質(zhì)

使用高鹽濃度的流動(dòng)相（例如：0.5M硫酸鈉，pH3溶液）或酸性水溶液（例如：磷酸鹽緩沖液，pH2.5）過柱清洗。

2 去除疏水性雜質(zhì)

在清洗液中添加10-20%的甲醇、乙腈等水溶性有機(jī)溶劑過柱清洗。

如果采用上述兩種方法清洗后色譜柱性能仍不能恢復(fù)，再考慮以下第③種方法。

3 去除難溶性蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)

在清洗液中添加6-8mol/L的尿素或0.2-0.3%的中性表面活性劑（Triton、Tween、Brij等）后過柱清洗。但需要留意的是尿素或中性表面活性劑可能會(huì)殘留在色譜柱上。

一般來說，清洗時(shí)間可選擇為過柱5-10個(gè)柱體積便可。在吸附成分其吸附力極強(qiáng)時(shí)，即使進(jìn)行過清洗，色譜柱性能也有可能得不到恢復(fù)。另外，請(qǐng)充分考慮清洗液的pH值，以避免損壞色譜柱。

氨基酸作為構(gòu)成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。
隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質(zhì)量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時(shí)含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動(dòng)相對(duì)其保留很弱，同時(shí)部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動(dòng)相和檢測(cè)器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結(jié)廣州菲羅門積累經(jīng)典色譜應(yīng)用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析四種廣受關(guān)注的應(yīng)用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對(duì)繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個(gè)難點(diǎn)：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應(yīng)在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)在C18柱+反相流動(dòng)相的體系下進(jìn)行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當(dāng)選擇氨基酸非衍生直接分析時(shí)，對(duì)于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實(shí)現(xiàn)保留，當(dāng)使用磷酸鹽類時(shí)，可以在截止波長條件下用UV檢測(cè)，比較經(jīng)典的應(yīng)用是用ACE HILIC-B檢測(cè)門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者M(jìn)S為檢測(cè)器的條件下分析氨基酸。

三、保護(hù)型氨基酸手性分析

當(dāng)氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護(hù)起來時(shí)，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實(shí)現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開發(fā)的時(shí)間。

四、非保護(hù)氨基酸直接手性分析

對(duì)于非保護(hù)的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機(jī)酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內(nèi)酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實(shí)現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結(jié): 本文全面總結(jié)了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析。

對(duì)于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術(shù)工程師。

氨基酸作為構(gòu)成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。

隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質(zhì)量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時(shí)含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動(dòng)相對(duì)其保留很弱，同時(shí)部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動(dòng)相和檢測(cè)器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結(jié)廣州菲羅門積累經(jīng)典色譜應(yīng)用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析四種廣受關(guān)注的應(yīng)用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對(duì)繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個(gè)難點(diǎn)：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應(yīng)在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)在C18柱+反相流動(dòng)相的體系下進(jìn)行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當(dāng)選擇氨基酸非衍生直接分析時(shí)，對(duì)于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實(shí)現(xiàn)保留，當(dāng)使用磷酸鹽類時(shí)，可以在截止波長條件下用UV檢測(cè)，比較經(jīng)典的應(yīng)用是用ACE HILIC-B檢測(cè)門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者M(jìn)S為檢測(cè)器的條件下分析氨基酸。

三、保護(hù)型氨基酸手性分析

當(dāng)氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護(hù)起來時(shí)，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實(shí)現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開發(fā)的時(shí)間。

四、非保護(hù)氨基酸直接手性分析

對(duì)于非保護(hù)的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機(jī)酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內(nèi)酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實(shí)現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結(jié): 本文全面總結(jié)了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析。

對(duì)于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術(shù)工程師。

引言

反相HPLC已成為分離和分析蛋白質(zhì)和多肽的重要工具。

它在生物技術(shù)行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類ZL產(chǎn)品的表征，以及這些產(chǎn)品和雜質(zhì)的鑒定。

在通過質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質(zhì)組中分離多肽方面有著至關(guān)重要的作用。

它也被用于探索性研究中多種蛋白質(zhì)和多肽的純化，以及蛋白類ZL藥物的大規(guī)模純化。

反相HPLC靈敏、通用性強(qiáng)，還可與質(zhì)譜等技術(shù)結(jié)合使用，在蛋白質(zhì)研究中具有重要的地位。

此外，它還能夠分離結(jié)構(gòu)近乎相同的蛋白質(zhì)，因而得到了廣泛的應(yīng)用。

正如牛、人和豬胰島素變異體的分離過程所示（圖1），反相HPLC能夠分離非常相似的蛋白質(zhì)。

牛胰島素和人胰島素僅有三個(gè)氨基酸的差別，也能夠被完全分離開來。

牛胰島素在胰島素“a”鏈的第8位為丙氨酸，第10位為纈氨酸，“b”鏈的第30位為丙氨酸。

而人胰島素在胰島素“a”鏈的第8位為蘇氨酸，第10位為異亮氨酸，“b”鏈的第30位為蘇氨酸。

圖1. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的胰島素變異體進(jìn)行分離

豬胰島素和人胰島素僅有一個(gè)氨基酸的差異（豬胰島素的“b”鏈第30位為丙氨酸，人胰島素該位置為蘇氨酸），在基線即已分離。  

在另一個(gè)實(shí)例中，盡管兔胰島素和人胰島素僅有一個(gè)氨基酸的差異，即以蘇氨酸取代了絲氨酸，但也同樣得到了分離（參考文獻(xiàn)1）。  

反相HPLC的高分離能力也被擴(kuò)展應(yīng)用到了多肽上。  

在圖2中，兩種多肽盡管只有一個(gè)氨基酸的差異，即絲氨酸對(duì)蘇氨酸，但也得到了完全的分離。  

這種高分離能力是反相HPLC在蛋白質(zhì)和多肽分離中得到廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)性因素。  

圖2. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的多肽進(jìn)行分離。僅有一個(gè)氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。  

蛋白質(zhì)/多肽的保留機(jī)制  

在反相HPLC中，顆粒表面是十分疏水的，因?yàn)槠浔砻嫱ㄟ^化學(xué)連接有羥基（圖3中的波浪形紅線）。  

通過疏水表面對(duì)蛋白質(zhì)一面（被稱為“疏水性足”）的吸附，蛋白質(zhì)被保留下來（圖3）。  

與疏水表面的厚度相比，蛋白質(zhì)要大得多，因此蛋白質(zhì)僅有一部分被疏水表面所吸附。  

大部分蛋白質(zhì)位于表面上方并與流動(dòng)相接觸。  

由這種疏水性吸附所導(dǎo)致的凈相互作用非常強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保持吸附在表面上（圖4A），直至接觸到特定濃度的有機(jī)溶劑，這時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)從表面上解吸附并從色譜柱上洗脫（圖4B）。  

在Z初的吸附/解吸附之后，盡管蛋白質(zhì)在從色譜柱上移動(dòng)下來時(shí)仍會(huì)與表面產(chǎn)生一些相互作用，但卻是十分微弱的，對(duì)分離過程無影響。  

分離是由單次吸附/解吸附過程完成的。  

解吸蛋白質(zhì)所需要的有機(jī)改性劑的濃度十分精確，并與疏水足的大小呈函數(shù)關(guān)系。  

詳情請(qǐng)參閱參考文獻(xiàn)3。  

圖4. 進(jìn)入色譜柱的蛋白質(zhì)被吸附在柱頂端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附，直至有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值，此時(shí)蛋白質(zhì)從表面解吸附（B）。  

在反相HPLC中，吸附/解吸保留機(jī)制導(dǎo)致蛋白質(zhì)的保留行為與小分子不同。  

小分子的保留行為隨著有機(jī)溶劑濃度的改變而緩慢改變時(shí)（圖5，聯(lián)苯），一旦有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到所需要的值，蛋白質(zhì)的保留行為即發(fā)生突然改變，引起保留時(shí)間的快速變化（圖5，蛋白質(zhì)）。  

該過程產(chǎn)生的尖銳峰形常見于蛋白質(zhì)和多肽（圖6A）。  

由于有機(jī)溶劑濃度的微小變化會(huì)引起的顯著的保留行為變化，等度洗脫很少被用于蛋白質(zhì)中，因?yàn)榉遄儗捔?，而有機(jī)溶劑的微小改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保留行為的巨大變化（圖6B）。

圖5.有機(jī)溶劑濃度對(duì)應(yīng)的保留行為  

圖6.  

A. 梯度洗脫過程中多肽和蛋白質(zhì)洗脫出尖銳峰形。  

B. 等度洗脫下，蛋白質(zhì)的峰形（本例中為溶菌酶）很寬，有機(jī)溶劑的微小改變都會(huì)引起保留時(shí)間的巨大變化。  

         液相色譜儀除了日常維護(hù)保養(yǎng)外，使用高純度溶劑不僅能保護(hù)液相系統(tǒng)，也能增加結(jié)果的可靠性。HPLC級(jí)表示化學(xué)試劑的純度，是可在GX液相色譜中使用的試劑的純度，制備色譜法、平行分析或梯度分析需要使用到不同的HPLC級(jí)試劑。

         樣品在注入液相系統(tǒng)前，必須選擇一種合適的HPLC溶劑。在反相GX液相色譜中，當(dāng)樣品溶劑與流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度有差異,尤其是前者的洗脫強(qiáng)度較強(qiáng)時(shí),就會(huì)產(chǎn)生峰的變形及柱效的降低。解決該問題最有效的方法是使用流動(dòng)相作為溶劑溶解樣品,這樣既可以避免樣品溶劑和流動(dòng)相之間任何強(qiáng)度或粘度的不匹配，也可以減少樣品分析時(shí)基線的漂移。溶劑在流動(dòng)相中起著重要的作用，并有助于將進(jìn)樣品通過分離柱后輸送到檢測(cè)器。為了滿足不同的分析要求，可以購買不同純度等級(jí)的溶劑來使用，HPLC分析需要使用高純度的溶劑，但是同時(shí)也要考慮成本和實(shí)用性等方面。

         HPLC級(jí)溶劑的純度通常超過99.9％，并且瓶身標(biāo)簽上還會(huì)標(biāo)明其他雜質(zhì)的含量。但是雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致多余的峰，從而干擾色譜圖中的主峰，對(duì)我們的分析結(jié)果產(chǎn)生干擾。雜質(zhì)產(chǎn)生的原因有很多，可能溶劑純度不夠，可能是瓶身不干凈或者軟管不干凈，還可能是溶劑吸濾頭的過濾雜質(zhì)效果不好。恒譜生不銹鋼流動(dòng)相進(jìn)樣口過濾器能安全有效地保護(hù)泵和止回閥，尺寸小，適用于各種品牌的HPLC系統(tǒng)和多種小瓶口的存儲(chǔ)池容器。吸濾阻力較小，幾乎沒有背壓和形成空化，兼容多種流動(dòng)相管路，無需換吸濾頭即可配不同規(guī)格的吸管，過濾微粒污染物效果好，無氣泡，溶劑利用率高。

        在整個(gè)紫外線可見波長范圍內(nèi)，沒有溶劑是100％透明的，常用的HPLC溶劑在一定波長范圍內(nèi)顯示出透明性。大多數(shù)應(yīng)用中會(huì)使用紫外線檢測(cè)器，因此所選的溶劑應(yīng)該盡可能具有低的紫外線截止波長，讓大多數(shù)的樣品組分在高于截止值的波長處顯示出可測(cè)量的吸收度。除此之外，溶劑的粘度越高，填充柱中固定相的阻力將導(dǎo)致背壓越高，因此所選溶劑也應(yīng)具有低粘度才是比較理想的。

        大多數(shù)的溶劑在密封瓶中才能維持它的穩(wěn)定性，但某些溶劑的保存期限有限。使用時(shí)要注意查看使用期，注意在有效期內(nèi)使用，不要購買過多的溶劑避免ZH用不完產(chǎn)生了浪費(fèi)行為。

      作為ZH的建議，所有溶劑在使用前通過進(jìn)樣口過濾器過濾并脫氣，這樣的預(yù)防措施將提高HPLC系統(tǒng)的使用壽命，也有助于增加分析結(jié)果的可靠性。

        誤區(qū)1：HPLC 柱不可以反沖

        這是不正確的。通常情況下液相色譜柱所設(shè)計(jì)的耐壓值是遠(yuǎn)高于最da操作壓力的。換柱時(shí)反沖可以清洗柱頭一些具有強(qiáng)吸附性質(zhì)的物質(zhì)，我們沖洗出這些殘留物質(zhì)也是為了防止壓力增大。但是如果你購買的色譜柱在柱頭使用了大粒度的填料，這時(shí)你反沖會(huì)沖出這一部分填料。因此你要先檢查一下自己使用的液相色譜柱再選擇是否反沖。

        誤區(qū)2：所有的C18（L1）色譜柱都是一樣的

        這是不正確的。在早期的HPLC體系中，C18是唯yi反向色譜的鍵合固定相，因此C18就作為了反向色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)。但是時(shí)代不會(huì)一直停滯腳步，人們對(duì)于科學(xué)的追求與理解愈發(fā)深刻，更多的固定相出現(xiàn)了，誕生了許多C18色譜柱。雖然同樣是選用硅膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。所以單純的因?yàn)槊Q都是C18色譜柱，想當(dāng)然覺得性能都一樣是不對(duì)的。

        誤區(qū)3：色譜柱里一旦進(jìn)入空氣就會(huì)損壞

        我們都知道當(dāng)色譜柱不與色譜儀連接的時(shí)候，需確保色譜柱被緊緊地密封。但是在實(shí)際應(yīng)用中，即使色譜柱的端部進(jìn)入了少量的空氣也不是很嚴(yán)重的事情。當(dāng)色譜柱連接到色譜儀上使用時(shí)，在系統(tǒng)初始加壓階段，在很短的時(shí)間內(nèi)空氣就會(huì)被溶劑擠壓排出。所以，不要因?yàn)樯V柱進(jìn)入了少量空氣就認(rèn)為色譜柱已被損壞。

        誤區(qū)4：保護(hù)柱是沒必要的

        這也是太JD的誤區(qū)，其實(shí)使用保護(hù)柱有很多好處。HPLC的移動(dòng)相中常使用各種試劑，其中會(huì)混有一些不溶解物質(zhì)或不純物質(zhì)。多數(shù)不溶物通過使用篩板或膜濾器過濾移動(dòng)相可以除去，但極細(xì)小的粒子還是無法完全過濾。此外在移動(dòng)相調(diào)制之后，還有通過空氣、容器、人體等有不溶物、不純物落入的可能性。這些不溶物、不純物質(zhì)會(huì)污染柱、或使堵塞、或給分析帶來不良影響等。這時(shí)通過在色譜柱前安裝分析保護(hù)柱可以防止其產(chǎn)生，能起保護(hù)色譜柱的作用。相較于更換一根昂貴的分析柱，添加或更換保護(hù)柱只需要很少的花費(fèi)。恒譜生液相色譜保護(hù)柱幾乎無死體積、便于更換，適用于UHPLC系統(tǒng)的高壓，將那些強(qiáng)保留的、不可吸附的化合物截留下來。樣品和流動(dòng)相的過濾可以維護(hù)保護(hù)柱對(duì)化學(xué)污染物的吸附容量，能夠更長時(shí)間的維護(hù)柱效，延長色譜柱的使用壽命。

        誤區(qū)5：反相色譜柱不可以使用純水相

        這也是不正確的，有些色譜工作者在使用低有機(jī)溶劑含量或者純水作為反相色譜柱的流動(dòng)相時(shí)，發(fā)生相塌陷的現(xiàn)象，所以有些人認(rèn)為反相色譜柱不可以使用純水相。但事實(shí)上市場(chǎng)上銷售的反相色譜柱（如極性嵌入和極性封端柱）都是具有水浸潤性的，其表面特性是允許使用純水的，不會(huì)導(dǎo)致塌陷或者保留時(shí)間移位。

        誤區(qū)6：色譜柱填料粒徑越小、壓力越高，分離效果越好

　　色譜柱性能的好壞不能單純用填料是否是超小的粒徑以及超高的柱壓來評(píng)估?，F(xiàn)代對(duì)于色譜柱的柱特性研究越來越深入，已經(jīng)研發(fā)了一些能夠提高色譜柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色譜柱，其柱效與sub-2μm UHPLC柱效一樣好，與常規(guī)的LC填料色譜柱比起來，柱壓很低。

　　誤區(qū)7：柱壓不會(huì)影響色譜分離效果

        近年來，柱壓的問題引起了很多色譜工作者的注意，柱壓是色譜的很多參數(shù)都是受柱壓影響的，包括部分溶質(zhì)的摩爾體積、停滯體積、柱孔隙度、保留因子、流動(dòng)相密度、介電常數(shù)、固定相結(jié)構(gòu)、pH值和電離常數(shù)等。當(dāng)色譜柱在約2000psi（13.789MPa）壓力下運(yùn)行時(shí)，即使保留時(shí)間上存在小差異，也并不會(huì)引起我們的注意；特別是如果重復(fù)性較好及定量不受影響的時(shí)候。但是，當(dāng)柱壓接近2000psi（13.789MPa）時(shí)，柱壓的影響可能就相當(dāng)明顯了。

        近幾十年來，液相色譜法被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，藥物分析，食品分析，環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，人們對(duì)于液相色譜法的不斷研究，也誕生出更多的液相色譜應(yīng)用以及解決方法等，相信未來液相色譜法的應(yīng)用領(lǐng)域會(huì)更加廣闊。

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HPLC色譜柱失效的Z常見原因之一是色譜柱入口篩板上聚集的顆粒物質(zhì)，導(dǎo)致背壓較高和/或峰形變形。

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