誤區(qū)1：HPLC 柱不可以反沖

        這是不正確的。通常情況下液相色譜柱所設計的耐壓值是遠高于最da操作壓力的。換柱時反沖可以清洗柱頭一些具有強吸附性質(zhì)的物質(zhì)，我們沖洗出這些殘留物質(zhì)也是為了防止壓力增大。但是如果你購買的色譜柱在柱頭使用了大粒度的填料，這時你反沖會沖出這一部分填料。因此你要先檢查一下自己使用的液相色譜柱再選擇是否反沖。

        誤區(qū)2：所有的C18（L1）色譜柱都是一樣的

        這是不正確的。在早期的HPLC體系中，C18是唯yi反向色譜的鍵合固定相，因此C18就作為了反向色譜柱的標準。但是時代不會一直停滯腳步，人們對于科學的追求與理解愈發(fā)深刻，更多的固定相出現(xiàn)了，誕生了許多C18色譜柱。雖然同樣是選用硅膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。所以單純的因為名稱都是C18色譜柱，想當然覺得性能都一樣是不對的。

        誤區(qū)3：色譜柱里一旦進入空氣就會損壞

        我們都知道當色譜柱不與色譜儀連接的時候，需確保色譜柱被緊緊地密封。但是在實際應用中，即使色譜柱的端部進入了少量的空氣也不是很嚴重的事情。當色譜柱連接到色譜儀上使用時，在系統(tǒng)初始加壓階段，在很短的時間內(nèi)空氣就會被溶劑擠壓排出。所以，不要因為色譜柱進入了少量空氣就認為色譜柱已被損壞。

        誤區(qū)4：保護柱是沒必要的

        這也是太JD的誤區(qū)，其實使用保護柱有很多好處。HPLC的移動相中常使用各種試劑，其中會混有一些不溶解物質(zhì)或不純物質(zhì)。多數(shù)不溶物通過使用篩板或膜濾器過濾移動相可以除去，但極細小的粒子還是無法完全過濾。此外在移動相調(diào)制之后，還有通過空氣、容器、人體等有不溶物、不純物落入的可能性。這些不溶物、不純物質(zhì)會污染柱、或使堵塞、或給分析帶來不良影響等。這時通過在色譜柱前安裝分析保護柱可以防止其產(chǎn)生，能起保護色譜柱的作用。相較于更換一根昂貴的分析柱，添加或更換保護柱只需要很少的花費。恒譜生液相色譜保護柱幾乎無死體積、便于更換，適用于UHPLC系統(tǒng)的高壓，將那些強保留的、不可吸附的化合物截留下來。樣品和流動相的過濾可以維護保護柱對化學污染物的吸附容量，能夠更長時間的維護柱效，延長色譜柱的使用壽命。

        誤區(qū)5：反相色譜柱不可以使用純水相

        這也是不正確的，有些色譜工作者在使用低有機溶劑含量或者純水作為反相色譜柱的流動相時，發(fā)生相塌陷的現(xiàn)象，所以有些人認為反相色譜柱不可以使用純水相。但事實上市場上銷售的反相色譜柱（如極性嵌入和極性封端柱）都是具有水浸潤性的，其表面特性是允許使用純水的，不會導致塌陷或者保留時間移位。

        誤區(qū)6：色譜柱填料粒徑越小、壓力越高，分離效果越好

　　色譜柱性能的好壞不能單純用填料是否是超小的粒徑以及超高的柱壓來評估?，F(xiàn)代對于色譜柱的柱特性研究越來越深入，已經(jīng)研發(fā)了一些能夠提高色譜柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色譜柱，其柱效與sub-2μm UHPLC柱效一樣好，與常規(guī)的LC填料色譜柱比起來，柱壓很低。

　　誤區(qū)7：柱壓不會影響色譜分離效果

        近年來，柱壓的問題引起了很多色譜工作者的注意，柱壓是色譜的很多參數(shù)都是受柱壓影響的，包括部分溶質(zhì)的摩爾體積、停滯體積、柱孔隙度、保留因子、流動相密度、介電常數(shù)、固定相結構、pH值和電離常數(shù)等。當色譜柱在約2000psi（13.789MPa）壓力下運行時，即使保留時間上存在小差異，也并不會引起我們的注意；特別是如果重復性較好及定量不受影響的時候。但是，當柱壓接近2000psi（13.789MPa）時，柱壓的影響可能就相當明顯了。

        近幾十年來，液相色譜法被廣泛應用于生命科學領域，藥物分析，食品分析，環(huán)境監(jiān)測等領域，人們對于液相色譜法的不斷研究，也誕生出更多的液相色譜應用以及解決方法等，相信未來液相色譜法的應用領域會更加廣闊。

ACE色譜柱柱前過濾器
使用Advanced Chromatography Technologies的品質(zhì)柱前過濾器可以保護您的HPLC和UHPLC色譜柱免于過早失效。
HPLC色譜柱失效的Z常見原因之一是色譜柱入口篩板上聚集的顆粒物質(zhì)，導致背壓較高和/或峰形變形。

據(jù)估計，超過70％的HPLC色譜柱失效是由入口篩板堵塞引起的。UHPLC色譜柱（特別是那些用2μm以下顆粒填充的色譜柱）特別容易受入口篩板堵塞的影響。
Advanced Chromatography Technologies可以提供三種不同的柱前過濾器，每種過濾器均為色譜柱的特殊保護而設計。

保護您的HPLC和UHPLC色譜柱免于過早失效

1.利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過去幾年里，柱效和使用超GX色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實現(xiàn)分離目標的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過更快速的分離和更快速的方法開發(fā)提高實驗室生產(chǎn)力來證明了其價值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個參數(shù)中，選擇性是Z為重要的。

（參見圖1）通過利用柱效和選擇性，通?？梢詫崿F(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發(fā)分離方法時的Z佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機制，這可以用來實現(xiàn)分離。

這些相互作用機制包括：疏水性結合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機制，這取決于分析物和流動相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機制/相互作用                                                                                  

利用鍵合相的選擇性實現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機制（特別是疏水性結合）的強度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機制，可以為復雜的混合物帶來更好的分離效果。對于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢。

當開發(fā)分離方法時，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機制。

非常強大且獨特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過利用柱效和選擇性，可以實現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實例。

一個分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得zhuo越的分離度和峰形：藥物及其相關物質(zhì)的UHPLC結果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測：UV 254 nm

樣品
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。

2.ACE和ACE Excel硅膠基質(zhì)固定相幾乎消除了硅醇基對色譜分離的不利影響，并且在為堿性化合物提供zhuo越峰形方面贏得了口碑。  

峰拖尾可以降低分離度，降低靈敏度，甚至干擾準確度和精密度（圖4）。  

峰拖尾有許多潛在的原因，但分離堿性物質(zhì)時的主要原因是硅膠固定相載體顆粒表面上的酸性硅醇基與分析物上的氨基之間的相互作用（圖5）。  

圖 4：峰拖尾對分離度和靈敏度的影響  

隨著峰拖尾（Tf，拖尾因子）從1.0增加到2.0，分離度（Rs）從1.5下降到0.87。  

由于峰寬增加以及峰面積保持不變，靈敏度（峰高）也隨著峰拖尾的增加而下降。  

ACE色譜柱采用具有極低硅醇活性的超惰性硅膠制成。  

這種超純硅膠采用ZL技術進行有效鍵合和徹底封尾。  

導致這種硅膠基質(zhì)的固定相幾乎消除了硅醇基對色譜分離的不利影響。  

ACE色譜柱的超惰性特性使其成為分離極性堿性化合物的理想選擇。  

當分離復雜堿性化合物時,與其他現(xiàn)代堿性去活色譜柱相比，ACE色譜柱總是能給出明顯更好的峰形和柱效（圖6）。  

圖 5：峰拖尾相互作用  

硅膠固定相載體表面上的酸性硅醇基可形成與堿性化合物相互作用的離子交換位點。  

這種離子交換的相互作用通?？梢詫е路灞Ａ簦ǘ伪Ａ簦敳捎梅聪郒PLC分離胺類化合物時引起峰拖尾。  

一種幾乎消除了硅醇基對色譜分離不利影響的硅膠基質(zhì)固定相  

圖 6：峰拖尾比較  

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm
流動相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
溫度：22oC
樣品：吡啶  

報告了堿性化合物（吡啶）在各種常見C18色譜柱上的塔板數(shù)。  

在10％峰高下測量塔板數(shù)，以使峰拖尾納入在測量中。  

ACE C18-PFP由于其超惰性性質(zhì)而達到了Z高塔板數(shù)。  

3.ACE Excel為UHPLC帶來了享有盛譽的ACE HPLC性能  

重要的是要認識到色譜柱的選擇性和柱效是獨立的變量，在開發(fā)分離方法時您不必選擇使用一種而不使用另一種。事實上，為了實現(xiàn)Z佳的總體分離效果，您應當對上述兩個變量以及保留值進
行優(yōu)化。當需要實現(xiàn)高速分離時尤其如此。（參見圖7）  

圖 7：利用柱效和鍵合相選擇性來開發(fā)更快的分離方法  

條件：
流動相：  

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱溫：40℃
檢測：PDA, 254nm  

樣品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯  

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色譜柱更高的柱效，可在更高的流動相流速下使用更短的色譜柱，以使這種混合物的分離時間縮短80%（相比HPLC色譜柱）。
然而，也可以通過優(yōu)化鍵合相的選擇性來進一步縮短分離時間，在這個案例中，就是利用了C18-PFP鍵合相所具有的增強的選擇性。

與C18UHPLC色譜柱、C18 HPLC色譜柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色譜柱分別將混合物的分離時間縮短了80％以上以及96％，同時保持了所有峰的分離度。

ACE Excel UHPLC色譜柱的設計旨在充分利用低擴散、超高壓UPLC?和UHPLC儀器（高達1000 bar），并可與所有市售UPLC和UHPLC系統(tǒng)相兼容。
ACE Excel UHPLC色譜柱可以為堿性化合物提供更佳的峰形，改善柱子與柱子之間的重現(xiàn)性，提供額外的利用多種分離機制的固定相，以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色譜柱的可用性意味著色譜分析師在使用UPLC和UHPLC儀器時有更多的選擇來獲得更好的結果。

圖 8：ACE Excel色譜柱提供快速、高分辨率的分離

條件
色譜柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流動相：60秒內(nèi)從30%B至B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱溫：40oC
壓力：703 bar (10,335 psi)
檢測：PDA, 254 nm
儀器：安捷倫1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色譜柱可在不到60秒內(nèi)提供這9種分析物的基線分離。

4.已經(jīng)證實ACE HPLC色譜柱和ACE Excel UHPLC色譜柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和zhuo越的色譜柱壽命。  

通過鍵合在硅膠固定相載體上的硅氧烷的酸化水解可以失去鍵合相，從而降低色譜柱的壽命。該酸水解隨著流動相pH的降低和柱溫的升高而增加。  

與C18相相比，較短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去鍵合相。此外，低純度的硅膠固定相載體和低表面覆蓋的固定相載體使得一些鍵合相更易于酸解。
由于使用超高純度的硅膠固定載體粒子以及鍵合相的極高表面覆蓋，ACE鍵合相表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性。（參見圖9）
盡管所有ACE鍵合相的穩(wěn)定性都很優(yōu)異，但是一些鍵合相并不像其它鍵合相那樣穩(wěn)定。例如，通常認為C18鍵合比柱長較短的烷基相、PFP相和苯基鍵合相更穩(wěn)定。  

實際上，典型的苯基固定相穩(wěn)定性不佳是該相在方法開發(fā)中不常被選擇的主要原因之一。
為了解決這個問題而開發(fā)了ACE C18-AR，其允許色譜分析利用強大的π-π和偶極-偶極分離機制，并仍然享有C18相的堅固性及耐用性。  

如圖10所示，ACE C18-AR不僅對典型的苯基鍵合相具有非常優(yōu)異的穩(wěn)定性，它甚至還比許多其他C18鍵合相表現(xiàn)出更佳的穩(wěn)定性。  

類似地，ACE C18-PFP提供了多種分離機制，可以利用它們實現(xiàn)更佳的總體分離效果，同時從C18相的穩(wěn)定性中受益。  

圖 9：酸穩(wěn)定性，pH 1.8  

條件
色譜柱：ACE 4.6 x 150 mm
流動相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
溫度：22 °C
分析物：菲  

酸性暴露條件：
流動相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
溫度：22 ℃  

圖10：加速柱穩(wěn)定性研究：pH 1.9時80℃  

酸性暴露條件：
流動相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
溫度：80 ℃
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲  

使用設計用于加速柱降解下的條件，ACE C18-AR相顯示保留損失極少，其壽命相當于高度穩(wěn)定的ACE C18相。兩種固定相均由相同的超純硅膠而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾視作在高溫和低pH條件下具有極好穩(wěn)定性的固定相）。
正如預期的那樣，基于低純度硅膠（Waters Spherisorb ODS2）的C18鍵合柱在這些加速條件下壽命大大降低。
特別值得注意的是常規(guī)苯基色譜柱與ACE C18-AR的壽命比較結果。與ACE C18-AR相比，盡管使用高純度二氧化硅，苯基色譜柱的壽命仍降低，這表明ACE C18-AR可能適用于那些使用苯丙基色譜柱壽命短的應用。  

將HPLC和UHPLC連接到通常被稱為LC-MS的質(zhì)譜儀上已經(jīng)相當普遍。  

然而，質(zhì)譜對可能從HPLC/UHPLC色譜柱上洗脫下來的微量的鍵合相（稱為柱“流失”）非常敏感。柱  

流失可能會干擾分析結果，并且重要的是，LC-MS應用中所選擇的色譜柱具有足夠穩(wěn)定的鍵合相以避免過量的柱流失。  

圖11表明ACE C18-PFP色譜柱幾乎沒有“流失”干擾LC-MS分析。  

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的穩(wěn)定性使得這些色譜柱更適合LC-MS應用。  

圖 11：ACE C18-PFP色譜柱的低柱流失使其成為LC/MS應用中的理想選擇  

條件
色譜柱尺寸：50 x 3.0 mm
流動相：梯度：在5分鐘內(nèi)從5至95% B，95% B時持續(xù)5分鐘
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
溫度：60oC
檢測：安捷倫1100 MSD ESI正離子快速掃描模式,快速掃描全50 – 1000 m/z
樣品：空白運行  

柱流失可能會干擾LC-MS應用中目標分析物的檢測和測量。  

ACE C18-PFP色譜柱未顯示柱流失。  

所有ACE色譜柱的低流失特性使其非常適合LC-MS應用。  

UHPLC色譜柱可能缺乏耐用性。加上入口篩板堵塞的可能性，您可能面臨色譜柱的耐用性不如HPLC色譜柱的問題。  

ACE Excel色譜柱非常寬容，并提供您期望從HPLC色譜柱中獲得的相同耐用性和使用壽命。  

ACE Excel將改變您對UHPLC色譜柱耐用性的看法。  

ACE Excel色譜柱不僅填裝的更好，還采用了ZL的入口篩板設計，使其比其它UHPLC色譜柱更不容易被堵塞。  

仍建議您像使用任何UHPLC色譜柱一樣過濾樣品和流動相，但ACE Excel色譜柱比其他UHPLC色譜柱更為寬容，并提供與HPLC色譜柱相同的耐用性和使用壽命。  

圖 12：ACE Excel色譜柱在耐用性方面有良好的口碑  

將2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色譜柱在平均1,000 bar（14,500 psi）壓力下進行2000多個梯度的運行。  

在該穩(wěn)定性研究結束時，柱效（塔板數(shù)）和保留時間基本保持不變。  

5.ACE Excel色譜柱具有口碑zhuo越的可重現(xiàn)性。  

柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性受硅膠固定相載體的生成、固定相與固定相載體的鍵合以及色譜柱中固定相的填充的影響。  

在色譜柱的制備過程中，每個階段被控制得越好，色譜柱的可重現(xiàn)性和質(zhì)量則越好。
ACE色譜柱在色譜柱制備過程中的每個階段均得到了全面控制。  

這些控制措施確保ACE色譜柱在柱間以及批次之間產(chǎn)生可靠且可預測的性能。  

圖13提供了典型批次驗證測試的實例。  

硅醇活性的細微變化是柱子與柱子之間選擇性變化的主要原因之一。  

ACE和ACE Excel色譜柱由于使用超純試劑和嚴格的制造工藝控制（可以獲得具有均一表面特性的高純度硅膠固定相載體）而具有出色的可重現(xiàn)性。  

將這種高純度硅膠與先進的鍵合技術相結合，可以產(chǎn)生一系列高惰性的固定相，這些固定相幾乎消除了色譜中的硅醇干擾，從而提供zhuo越的柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性。  

6.ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴展性。  

相同的質(zhì)量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進行轉換，或需要分離和純化目標化合物時放大到制備應用上。  

柱效當然會改變，但可以預料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。  

圖14闡明了當使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進行操作時，可以預見到分析物一致的譜帶間距類型（選擇性）。  

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對羥基苯甲酸乙酯

試驗樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明分離從UHPLC擴展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當使用ACE Excel UHPLC色譜柱進行快速方法開發(fā)，且該方法必須可轉移到HPLC時，易擴展性則顯得特別有價值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動相：1.4分鐘內(nèi)從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內(nèi)從30至90％B，在90％B時持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明ACE固定相的選擇性一致，無論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉移更加容易。同時也使得從分析型應用擴展到制備型應用更加容易。

ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴展性。

相同的質(zhì)量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進行轉換，或需要分離和純化目標化合物時放大到制備應用上。

柱效當然會改變，但可以預料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。

圖14闡明了當使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進行操作時，可以預見到分析物一致的譜帶間距類型（選擇性）。

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對羥基苯甲酸乙酯

試驗樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明分離從UHPLC擴展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當使用ACE Excel UHPLC色譜柱進行快速方法開發(fā)，且該方法必須可轉移到HPLC時，易擴展性則顯得特別有價值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動相：1.4分鐘內(nèi)從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內(nèi)從30至90％B，在90％B時持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明ACE固定相的選擇性一致，無論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉移更加容易。同時也使得從分析型應用擴展到制備型應用更加容易。

ACE? UHPLC 可重復使用的色譜柱連接器

• 壓力額定值> 1700bar（> 25000psi）

• 與所有UHPLC系統(tǒng)兼容

• 與所有UHPLC色譜柱品牌兼容

• 消除連接不良

• 創(chuàng)新且可重復使用的設計

所有UHPLC色譜柱品牌都需要正確安裝，以實現(xiàn)Z大柱效。

為了避免出現(xiàn)問題，不推薦使用型壓制接頭，因為這些接頭在安裝時不允許在管道、接頭與色譜柱入口之間自由移動。

這可能會導致色譜柱連接不良，進而由于向系統(tǒng)引入了額外的柱體積（死體積）表現(xiàn)出非預期的峰拖尾。

或者，可以觀察到入口接頭連接處有泄漏。
ACE UHPLC色譜柱連接器（p/n EXL-CC）可重復使用，每次均可以使UHPLC色譜柱得到正確安裝。

它們獨特的設計確保它們可以隨著重復使用保持壓力等級，但無需性地焊在入口管道上。

為了使接頭的使用壽命盡可能Z大，需要使用ACE扭矩扳手（p/n EXL-TW）。
標準ACE HPLC PEEK手指連接器（p/n ACE-FT，壓力額定值為350bar / 5000psi）可用在UHPLC色譜柱出口端處，該處壓力要求較低，但正確的連接仍然很重要。

近年來，UHPLC系統(tǒng)在小分子分析中的應用已得到了研究人員的廣泛認可。UHPLC系統(tǒng)是在常規(guī)HPLC系統(tǒng)上對死體積、進樣性能和檢測器采樣率等方面進行了優(yōu)化，能夠承受超過1000 bar的操作壓力。因此，對于在常規(guī)HPLC系統(tǒng)上開發(fā)的方法，使用UHPLC儀器和HPLC色譜柱更能夠發(fā)揮優(yōu)勢。

如果在UHPLC系統(tǒng)上使用常規(guī)HPLC色譜柱，就不需要再去購買UHPLC色譜柱并開發(fā)新的方法，這樣可以節(jié)省相當?shù)某杀竞蜁r間。

本應用展示了常規(guī)TSKgel HPLC色譜柱在UHPLC系統(tǒng)上出色的分離性能。

應用實例(一)

使用陽離子交換色譜柱TSKgel SP-STAT分別在HPLC系統(tǒng)(藍色譜圖) 和UHPLC系統(tǒng) (紅色譜圖) 上，分析單克隆抗體IgG的情況。實驗中采用了相同的色譜柱、樣品以及分析方法，以驗證色譜柱-系統(tǒng)的兼容性。

結果表明，SP-STAT色譜柱在UHPLC系統(tǒng)中的理論塔板數(shù)要高6%，明顯優(yōu)于在HPLC系統(tǒng)中的性能。

圖1. SP-STAT色譜柱分析IgG的譜圖

圖2是使用SP-STAT色譜柱考察了在常規(guī)HPLC系統(tǒng)和UHPLC系統(tǒng)中，單克隆抗體異構體洗脫曲線被優(yōu)化的程度。UHPLC色譜圖的峰寬更窄。系統(tǒng)死體積減少導致峰洗脫早于HPLC系統(tǒng)。

圖2. SP-STAT色譜柱分析mAb電荷異構體的洗脫曲線

應用實例(二)

圖3是使用尺寸排阻色譜柱TSKgel G2000SWXL對標準蛋白混合物的分析情況。色譜柱在連接UHPLC系統(tǒng)時，對氨基苯甲酸 (PABA) 的理論塔板數(shù)超過了32000 (紅色譜圖)，而連接HPLC系統(tǒng)時，相同組分的理論塔板數(shù)只有29000 (藍色譜圖)。

圖3. 標準蛋白混合物的分離譜圖

當然，評估色譜性能時，分離度也是非常重要的一個指標。分析結果顯示，在分離γ-球蛋白和卵清蛋白時分離度為2.1，分離核糖核酸酶A和對氨基苯甲酸時分離度為10.2。而觀察UHPLC的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，對應峰的分離度分別提高到了2.2和10.9。

總結

以上兩個分析實例均表明，當使用UHPLC系統(tǒng)時，可獲得分離更好、分辨率更高的分析結果。UHPLC系統(tǒng)僅僅是優(yōu)化后的HPLC系統(tǒng)，因此從HPLC到UHPLC的方法轉移并不比從一臺HPLC儀器向另一臺HPLC儀器轉移要復雜多少。

以上應用中的操作壓力遠未超出常規(guī)HPLC系統(tǒng)的極限。大多數(shù)生物大分子的分離分析所采用的壓力大抵如此，但許多生物樣品分子本身無法承受太高的壓力。利用HPLC技術的ZX發(fā)展趨勢，將使用HPLC色譜柱已建立的HPLC方法轉移到UHPLC系統(tǒng)是一種經(jīng)濟、省時的策略。

ACE Excel UHPLC色譜柱與所有市售UPLC和UHPLC儀器兼容

Thermo Scientic Accela

Dionex UltiMate 3000

Waters

• Acquity UPLC

• Acquity UPLC H–Class

• Acquity UPLC I–Class

安捷倫科技

• 1290 Infinity

• 1220 Infinity

• 1260 Infinity
  

• 1200 Infinity

島津

• Nexera

• Prominence

加上許多其他品牌的UHPLC儀器，恕不能一一列舉

        大家都知道HPLC色譜柱的壽命是有限的，在使用過程中隨著時間的推移，其性能開始下降。你可以通過峰形和峰形之間的分離，柱背壓的不規(guī)律增加以及重影峰的出現(xiàn)來判斷HPLC色譜柱的性能出現(xiàn)了下降。色譜柱是昂貴的色譜耗材，平常使用完畢后需要保養(yǎng)。如果色譜柱真的發(fā)生了性能下降，有什么方法可以恢復呢?

        首先，如果色譜柱由于過載或使用不兼容的流動相而結垢，是可以恢復的，但已經(jīng)損壞的色譜柱或已經(jīng)過使用壽命的色譜柱無法恢復，需要更換。

        色譜柱還原程序如下，供大家參考：

        反相柱

        反相分離是大多數(shù)HPLC分離中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相組成。建議以水-乙腈-異丙醇-庚烷-異丙醇-乙腈-流動相的順序用10至20倍體積的溶劑洗脫

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍體積的溶劑沖洗，按照庚烷-異丙醇-乙腈-

       水-異丙醇-庚烷的順序。

        GPC / GFC色譜柱

        用5倍體 積且PH值為3的0.1%磷酸鹽緩沖液沖洗。如果使用了保留力強的蛋白質(zhì)，則使用從水到乙腈再到水的60分鐘梯度液沖洗。

        色譜柱在使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是zui佳條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。

        恒譜生色譜柱柱管由不銹鋼制成，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光，減小管壁效應，提高柱效，柱中填充鍵合硅膠或聚合物填料。色譜柱基于高純硅膠，采用獨特鍵合技術，具有優(yōu)異的峰形，靈敏性好?；|(zhì)金屬含量低，對所有類型的分析物均表現(xiàn)完好峰形。機械強度高，穩(wěn)定性好，質(zhì)控嚴格，確保色譜柱性能和色譜柱的使用壽命。有多種尺寸規(guī)格可供選擇以適應色譜工作者及其使用的不同需求。我們有專業(yè)的技術工程師團隊為您的需求提供解決方案，歡迎前來咨詢了解！

氨基酸作為構成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。
隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質(zhì)量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動相對其保留很弱，同時部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動相和檢測器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結廣州菲羅門積累經(jīng)典色譜應用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析四種廣受關注的應用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個難點：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團，可以實現(xiàn)在C18柱+反相流動相的體系下進行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當選擇氨基酸非衍生直接分析時，對于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實現(xiàn)保留，當使用磷酸鹽類時，可以在截止波長條件下用UV檢測，比較經(jīng)典的應用是用ACE HILIC-B檢測門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS為檢測器的條件下分析氨基酸。

三、保護型氨基酸手性分析

當氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護起來時，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開發(fā)的時間。

四、非保護氨基酸直接手性分析

對于非保護的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內(nèi)酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實現(xiàn)了有機酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結: 本文全面總結了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析。

對于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術工程師。

氨基酸作為構成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。

隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質(zhì)量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動相對其保留很弱，同時部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動相和檢測器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結廣州菲羅門積累經(jīng)典色譜應用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析四種廣受關注的應用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個難點：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團，可以實現(xiàn)在C18柱+反相流動相的體系下進行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當選擇氨基酸非衍生直接分析時，對于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實現(xiàn)保留，當使用磷酸鹽類時，可以在截止波長條件下用UV檢測，比較經(jīng)典的應用是用ACE HILIC-B檢測門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS為檢測器的條件下分析氨基酸。

三、保護型氨基酸手性分析

當氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護起來時，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開發(fā)的時間。

四、非保護氨基酸直接手性分析

對于非保護的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內(nèi)酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實現(xiàn)了有機酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結: 本文全面總結了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析。

對于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術工程師。

液相色譜柱的誤區(qū)