大家都知道HPLC色譜柱的壽命是有限的，在使用過程中隨著時間的推移，其性能開始下降。你可以通過峰形和峰形之間的分離，柱背壓的不規(guī)律增加以及重影峰的出現(xiàn)來判斷HPLC色譜柱的性能出現(xiàn)了下降。色譜柱是昂貴的色譜耗材，平常使用完畢后需要保養(yǎng)。如果色譜柱真的發(fā)生了性能下降，有什么方法可以恢復呢?

        首先，如果色譜柱由于過載或使用不兼容的流動相而結垢，是可以恢復的，但已經損壞的色譜柱或已經過使用壽命的色譜柱無法恢復，需要更換。

        色譜柱還原程序如下，供大家參考：

        反相柱

        反相分離是大多數HPLC分離中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相組成。建議以水-乙腈-異丙醇-庚烷-異丙醇-乙腈-流動相的順序用10至20倍體積的溶劑洗脫

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍體積的溶劑沖洗，按照庚烷-異丙醇-乙腈-

       水-異丙醇-庚烷的順序。

        GPC / GFC色譜柱

        用5倍體 積且PH值為3的0.1%磷酸鹽緩沖液沖洗。如果使用了保留力強的蛋白質，則使用從水到乙腈再到水的60分鐘梯度液沖洗。

        色譜柱在使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復性，或分離度。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是zui佳條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。

        恒譜生色譜柱柱管由不銹鋼制成，不銹鋼柱內壁多經過拋光，減小管壁效應，提高柱效，柱中填充鍵合硅膠或聚合物填料。色譜柱基于高純硅膠，采用獨特鍵合技術，具有優(yōu)異的峰形，靈敏性好。基質金屬含量低，對所有類型的分析物均表現(xiàn)完好峰形。機械強度高，穩(wěn)定性好，質控嚴格，確保色譜柱性能和色譜柱的使用壽命。有多種尺寸規(guī)格可供選擇以適應色譜工作者及其使用的不同需求。我們有專業(yè)的技術工程師團隊為您的需求提供解決方案，歡迎前來咨詢了解！

柱體積為LC柱內被洗脫劑占據的體積（即粒子之間的空間和粒子孔內空間）。

柱體積可根據以下公式計算：

Vm=πr2 Lε

其中：

Vm = 柱體積（單位：mL）

 r = 柱半徑（單位：cm）
L = 柱長度（單位：cm）

ε = 床層空隙度值

床層空隙度值ε取決于粒子參數（如孔徑、表面積等）和供應商。

對于ACE 100 ?多孔柱，ε值為~0.63；

對于ACE 300 ?多孔柱，ε值為~0.75；

而對于ACE 90 ?實芯柱，ε值為~0.55.
在討論柱平衡時，更準確的是引用達到穩(wěn)定狀態(tài)所需的柱體積，因為它與流速和柱尺寸（規(guī)格）無關。

例如，表1a示出了一系列ACE 100 ?多孔柱的柱體積值的計算。  

表 1a：ACE 100 ?多孔柱的體積計算值（單位：mL）

表2a顯示了各種流速條件下，4個不同尺寸的ACE 100 ?多孔柱達到20和60倍柱體積平衡所需的時間。

表 2a：ACE 100 ?多孔柱平衡計算

液相色譜儀柱壓高原因

ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴展性。

相同的質量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進行轉換，或需要分離和純化目標化合物時放大到制備應用上。

柱效當然會改變，但可以預料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。

圖14闡明了當使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進行操作時，可以預見到分析物一致的譜帶間距類型（選擇性）。

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對羥基苯甲酸乙酯

試驗樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明分離從UHPLC擴展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當使用ACE Excel UHPLC色譜柱進行快速方法開發(fā)，且該方法必須可轉移到HPLC時，易擴展性則顯得特別有價值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動相：1.4分鐘內從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內從30至90％B，在90％B時持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動相條件運行，結果闡明ACE固定相的選擇性一致，無論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉移更加容易。同時也使得從分析型應用擴展到制備型應用更加容易。

        誤區(qū)1：HPLC 柱不可以反沖

        這是不正確的。通常情況下液相色譜柱所設計的耐壓值是遠高于最da操作壓力的。換柱時反沖可以清洗柱頭一些具有強吸附性質的物質，我們沖洗出這些殘留物質也是為了防止壓力增大。但是如果你購買的色譜柱在柱頭使用了大粒度的填料，這時你反沖會沖出這一部分填料。因此你要先檢查一下自己使用的液相色譜柱再選擇是否反沖。

        誤區(qū)2：所有的C18（L1）色譜柱都是一樣的

        這是不正確的。在早期的HPLC體系中，C18是唯yi反向色譜的鍵合固定相，因此C18就作為了反向色譜柱的標準。但是時代不會一直停滯腳步，人們對于科學的追求與理解愈發(fā)深刻，更多的固定相出現(xiàn)了，誕生了許多C18色譜柱。雖然同樣是選用硅膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。所以單純的因為名稱都是C18色譜柱，想當然覺得性能都一樣是不對的。

        誤區(qū)3：色譜柱里一旦進入空氣就會損壞

        我們都知道當色譜柱不與色譜儀連接的時候，需確保色譜柱被緊緊地密封。但是在實際應用中，即使色譜柱的端部進入了少量的空氣也不是很嚴重的事情。當色譜柱連接到色譜儀上使用時，在系統(tǒng)初始加壓階段，在很短的時間內空氣就會被溶劑擠壓排出。所以，不要因為色譜柱進入了少量空氣就認為色譜柱已被損壞。

        誤區(qū)4：保護柱是沒必要的

        這也是太JD的誤區(qū)，其實使用保護柱有很多好處。HPLC的移動相中常使用各種試劑，其中會混有一些不溶解物質或不純物質。多數不溶物通過使用篩板或膜濾器過濾移動相可以除去，但極細小的粒子還是無法完全過濾。此外在移動相調制之后，還有通過空氣、容器、人體等有不溶物、不純物落入的可能性。這些不溶物、不純物質會污染柱、或使堵塞、或給分析帶來不良影響等。這時通過在色譜柱前安裝分析保護柱可以防止其產生，能起保護色譜柱的作用。相較于更換一根昂貴的分析柱，添加或更換保護柱只需要很少的花費。恒譜生液相色譜保護柱幾乎無死體積、便于更換，適用于UHPLC系統(tǒng)的高壓，將那些強保留的、不可吸附的化合物截留下來。樣品和流動相的過濾可以維護保護柱對化學污染物的吸附容量，能夠更長時間的維護柱效，延長色譜柱的使用壽命。

        誤區(qū)5：反相色譜柱不可以使用純水相

        這也是不正確的，有些色譜工作者在使用低有機溶劑含量或者純水作為反相色譜柱的流動相時，發(fā)生相塌陷的現(xiàn)象，所以有些人認為反相色譜柱不可以使用純水相。但事實上市場上銷售的反相色譜柱（如極性嵌入和極性封端柱）都是具有水浸潤性的，其表面特性是允許使用純水的，不會導致塌陷或者保留時間移位。

        誤區(qū)6：色譜柱填料粒徑越小、壓力越高，分離效果越好

　　色譜柱性能的好壞不能單純用填料是否是超小的粒徑以及超高的柱壓來評估?，F(xiàn)代對于色譜柱的柱特性研究越來越深入，已經研發(fā)了一些能夠提高色譜柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色譜柱，其柱效與sub-2μm UHPLC柱效一樣好，與常規(guī)的LC填料色譜柱比起來，柱壓很低。

　　誤區(qū)7：柱壓不會影響色譜分離效果

        近年來，柱壓的問題引起了很多色譜工作者的注意，柱壓是色譜的很多參數都是受柱壓影響的，包括部分溶質的摩爾體積、停滯體積、柱孔隙度、保留因子、流動相密度、介電常數、固定相結構、pH值和電離常數等。當色譜柱在約2000psi（13.789MPa）壓力下運行時，即使保留時間上存在小差異，也并不會引起我們的注意；特別是如果重復性較好及定量不受影響的時候。但是，當柱壓接近2000psi（13.789MPa）時，柱壓的影響可能就相當明顯了。

        近幾十年來，液相色譜法被廣泛應用于生命科學領域，藥物分析，食品分析，環(huán)境監(jiān)測等領域，人們對于液相色譜法的不斷研究，也誕生出更多的液相色譜應用以及解決方法等，相信未來液相色譜法的應用領域會更加廣闊。