最近一段時(shí)間，隨著疾病診療的精 準(zhǔn)化，各個(gè)版本新冠診療指南的出爐，淋巴細(xì)胞亞群、精細(xì)亞群和細(xì)胞因子等與免疫力監(jiān)控高度相關(guān)的指標(biāo)受到了高度關(guān)注。

在眾多的免疫指標(biāo)中，選擇哪些監(jiān)測(cè)指標(biāo)，如何建立自建方案并驗(yàn)證，如何建立與疾病診療相關(guān)指標(biāo)的Cutoff值，這些都是當(dāng)下流式工作者們開展更多免疫指標(biāo)時(shí)會(huì)遇到的一些難題。下面這篇文章對(duì)上面提到的幾個(gè)問題做了詳細(xì)的解答。

01.背景介紹

免疫檢查點(diǎn)抑 制劑治 療，特別是聯(lián)合PD-1/CTLA-4 阻斷，顯著提高了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的治 療率和總生存率 。但同時(shí)，與免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如肝炎和結(jié)腸炎，是免疫抑 制劑治 療過程中常見的并發(fā)癥，其嚴(yán)重的時(shí)候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中，巨細(xì)胞病毒 (CMV)引起的特異性記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肝損傷，而有研究表明治 療前血液中 CD4+ 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (TEM) 的擴(kuò)增能夠可靠地預(yù)測(cè)肝炎；所以如果有一種方案可以監(jiān)測(cè)效應(yīng)記憶T細(xì)胞，從而預(yù)測(cè)不良反應(yīng)的發(fā)生，其將具有很好的臨床意義。

本文章作者開發(fā)并驗(yàn)證了一個(gè)10色流式細(xì)胞方案，用于可靠地量化外周血樣本中的 CD4+ TEM細(xì)胞和其他 irAE 風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。與以前的方案相比，文章作者的新方案在測(cè)量CD4+ TEM細(xì)胞方面表現(xiàn)出色，并且在從CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T細(xì)胞（Na?ve T）分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央記憶T細(xì)胞 (TCM) 方面表現(xiàn)出色。它還能夠精確量化 CD14+單核細(xì)胞。

02.實(shí)驗(yàn)方案

CD4+ TEM細(xì)胞的標(biāo)記為CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。單核細(xì)胞的相同標(biāo)記為 CD45+CD14+，同時(shí)加上將 CD16，以對(duì)經(jīng)典、中間和非經(jīng)典單核細(xì)胞進(jìn)行更精細(xì)的分類。有研究表明將 CD8+ T 細(xì)胞中的 CD279 (PD-1) 表達(dá)確定為黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 療后臨床反應(yīng)的標(biāo)志物 ，因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。為了提高細(xì)胞類型定義的準(zhǔn)確性，方案中還包括了一個(gè)譜系排除 (Lin) 通道（CD19、CD20、CD56 和 CD66b）來排除B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和粒細(xì)胞。因此，新panel包括 10 個(gè)參數(shù)：CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16，作者將該方案命名為“monocyte and T cell”，簡(jiǎn)稱“MoT”。

該方案用Beckman Coulter的液體試劑進(jìn)行驗(yàn)證，并在驗(yàn)證完成后，作者將該方案定制成干粉形式，由于干粉產(chǎn)品相比較液體試劑，不僅可室溫保存，并且保存時(shí)間更久，同時(shí)還可以減少實(shí)驗(yàn)操作，樣本間一致性也更高等優(yōu)點(diǎn)，便于日常診斷工作并最 大限度地減少差異。

貝克曼庫(kù)爾特公司不僅可以提供Duraclone干粉成品試劑，還可以提供客戶定制CDS，可以根據(jù)客戶需求，個(gè)性化組合定制干粉方案。相比較液體方案來說，定制化的干粉組合方案，不僅有液體單抗方案的自由組合的優(yōu)點(diǎn)，而且還有干粉試劑的優(yōu)點(diǎn)。

03.方案圈門策略

該方案用貝克曼庫(kù)爾特公司的Navios 3激光10色儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，并使用Kaluza軟件進(jìn)行分析。

3.1  對(duì)CD45+ 白細(xì)胞進(jìn)行圈門；

3.2  對(duì)CD3+ T 細(xì)胞和CD3- 細(xì)胞進(jìn)行圈門；

3.3  對(duì)CD3-內(nèi)的譜系陰性 (Lin-) 細(xì)胞進(jìn)行圈門；對(duì)CD14+ 單核細(xì)胞進(jìn)行圈門；對(duì)由 CD14 和 CD16 表達(dá)定義的單核細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門；

3.4  對(duì)CD3+ T 細(xì)胞內(nèi)的CD4+ 和 CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行圈門；對(duì)CD4+ 記憶T細(xì)胞亞群進(jìn)行圈門；圈門CD279+ CD8+ T細(xì)胞。

04.檢測(cè)性能驗(yàn)證

文章作者將此方案與貝克曼庫(kù)爾特公司的DURAClone IM T 細(xì)胞亞群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了來自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的樣本，其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 單核細(xì)胞外，其他參數(shù)均觀察到方法之間的強(qiáng)相關(guān)性，CD14+ 單核細(xì)胞顯示出中等相關(guān)性。

DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是貝克曼庫(kù)爾特公司的Duraclone IM全套抗體組合方案中的第1管與第3管。該產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)是干粉，保存的時(shí)間比液體更久；而且預(yù)混抗體也能節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，相比于自己混勻抗體后分裝染色，樣本間的一致性會(huì)更高。產(chǎn)品質(zhì)量滿足ISO 9001認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)（ISO 9001-2008）。

文章作者之前確立了一個(gè)cutoff值≥16% CD4+ TEM 細(xì)胞作為 CMV Ig+ 患者檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)肝炎的預(yù)測(cè)因子。因此在將患者分類為 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 時(shí)，DURAClone IM T 細(xì)胞亞群管和 MoT測(cè)試管結(jié)果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外，E圖顯示在確定 CMV 血清學(xué)狀態(tài)，并在治 療開始后 12 周內(nèi)評(píng)估免疫相關(guān)肝炎的發(fā)展。紅色虛線表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值， 中值用黑線表示，MoT 方案在預(yù)測(cè) 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表現(xiàn)良好。F圖顯示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正確預(yù)測(cè)了肝炎。

經(jīng)過驗(yàn)證，文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 細(xì)胞作為 CMV Ig+ 患者檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)肝炎的預(yù)測(cè)因子，相關(guān)的PPV=83%，NPV=80%。

另外，文章作者還從批內(nèi)精密度、批間精密度、操作者間分析精度、樣本穩(wěn)定性、樣本染色穩(wěn)定性、年齡、性別和疾病相關(guān)偏倚、季節(jié)性等方面進(jìn)行了驗(yàn)證，確保該方案結(jié)果是在可接受范圍內(nèi)的，由于篇幅的關(guān)系，就不一一列出來了，感興趣的讀者可以去原文查看，其詳細(xì)的介紹了作者驗(yàn)證思路與結(jié)果。