熒光檢測器符合郎伯-比爾定律嗎?

樣品制備 — 從基質(zhì)中分離出目標(biāo)分析物，并盡可能去除干擾，是生物分析工作流程的關(guān)鍵組成部分。為了獲得準(zhǔn)確、精密、可重現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，往往需要熟練且有經(jīng)驗(yàn)的分析人員，因?yàn)槿魏五e(cuò)誤或不一致都可能導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確或重做。這些錯(cuò)誤或不一致包括在生成校準(zhǔn)曲線和QC樣品時(shí)的移液錯(cuò)誤、遺漏或錯(cuò)誤標(biāo)記的樣品、不正確的試劑添加等情況。

將自動化引入生物分析實(shí)驗(yàn)室不僅有助于最小化或消除這些挑戰(zhàn)，還可以解放分析人員的雙手，使其能夠從事其他更高價(jià)值的工作。

下面小編就向大家介紹如何使用Andrew+移液機(jī)器人制備校準(zhǔn)曲線，對QC樣品（血漿中的多種小分子藥物）進(jìn)行稀釋。目標(biāo)分析物包括乙酰唑胺、撲熱息痛、潑尼松、2-甲基苯甲酰胺、可的松、美托洛爾和阿米替林。然后，使用Andrew+搭配Extraction+模塊，對樣品進(jìn)行全自動SPE。制備好的樣品使用LC-MS進(jìn)行定量分析，獲得校準(zhǔn)曲線結(jié)果以及重現(xiàn)性和回收率指標(biāo)。

圖1. Andrew+搭配Extraction+ SPE新模塊，執(zhí)行自動化SPE樣品制備和LC-MS分析工作流，分別使用Oasis HLB SPE小柱和SPE萃取板。

 優(yōu)勢

使用Andrew+ Robot搭配Extraction+固相萃取新模塊，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、QC樣品稀釋和無人值守的全自動SPE工作流；

OneLab軟件擁有簡潔直觀的用戶界面，便于用戶輕松設(shè)計(jì)和執(zhí)行各種自動化樣品制備方案，輕松實(shí)現(xiàn)方法創(chuàng)建和方法轉(zhuǎn)移；

1cc、3cc和6cc固相萃取小柱或96孔萃取板均可在Extraction+互聯(lián)設(shè)備上實(shí)現(xiàn)固相萃取；

受OneLab軟件控制的可編程的真空泵壓力曲線可提高SPE方法的重現(xiàn)性。

實(shí)驗(yàn)方案一

制備校準(zhǔn)曲線，樣品稀釋，使用Oasis HLB 1cc SPE小柱執(zhí)行固相萃取 

樣品進(jìn)行反相固相萃取工作流：

*注意：沃特世于1996年推出Oasis HLB, 是所有Oasis吸附劑的主要成分?？赡褪躳H 0-14，采用獨(dú)特的水可浸潤性聚合物吸附劑，省去了活化和平衡步驟，是SPE的新標(biāo)桿。

以Andrew+移液機(jī)器人進(jìn)行全自動SPE為例，介紹OneLab軟件中的自動化方法，Andrew+將上圖所示的SPE步驟自動化。

圖2. 左側(cè)為OneLab的方法創(chuàng)建界面，右側(cè)為SPE工作流使用的移液槍、槍頭、Dominos和Device物料清單。

Andrew+移液機(jī)器人搭載Extraction+ SPE新模塊的儀器配置如下圖，包括：

Andrew+ Robot主機(jī)；

微孔板抓手（自動移動96孔板）；

Extraction+配套的真空泵（壓力曲線受軟件控制）；

廢液瓶（上樣和清洗產(chǎn)生的廢液，經(jīng)真空泵抽取，進(jìn)入廢液瓶）；

Extraction+配套的萃取套件（上部放置SPE小柱或萃取板，下部放置收集容器）；

放置SPE小柱或萃取板的位置（左側(cè)升降Lifter可將承載SPE小柱的架子移到左側(cè)，以便用微孔板抓手將收集容器放入下部）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用 沃特世ACQUITY UPLC I-Class液相系統(tǒng)搭載快速柱進(jìn)行色譜分離，再用 Xevo TQ-XS串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀對從血漿中萃取出的小分子藥物進(jìn)行檢測。分析3個(gè)濃度的血漿樣品(Low QC-10 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-150 ng/mL)，回收率范圍是95.8% - 108.4%，精密度結(jié)果是幾乎所有RSD%值≤5%。這些結(jié)果滿足FDA對小分子生物分析方法驗(yàn)證的推薦限值。

表1. 回收率和重現(xiàn)性結(jié)果 — Andrew+執(zhí)行血漿樣品制備，Extraction+搭載Oasis HLB 1cc SPE小柱執(zhí)行全自動SPE。

實(shí)驗(yàn)方案二

制備校準(zhǔn)曲線，樣品稀釋，使用Oasis HLB 30mg 萃取板執(zhí)行固相萃取 

與實(shí)驗(yàn)方案一執(zhí)行同樣的反相固相萃取工作流，萃取耗材是Oasis HLB 30 mg plates。

 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用沃特世ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)搭載快速柱進(jìn)行色譜分離，再用Xevo TQ-XS串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀對從血漿中萃取出的小分子藥物進(jìn)行檢測。分析3個(gè)濃度的血漿樣品(Low QC-20 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-400 ng/mL)，回收率范圍是88.6% - 110.8%，精密度結(jié)果是大多數(shù)RSD%值≤5%。這些結(jié)果滿足FDA對小分子生物分析方法驗(yàn)證的推薦限值。

表2. 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果 — Andrew+執(zhí)行血漿樣品制備，Extraction+搭載Oasis HLB 30 mg plates執(zhí)行全自動SPE。