樣品制備 — 從基質中分離出目標分析物，并盡可能去除干擾，是生物分析工作流程的關鍵組成部分。為了獲得準確、精密、可重現的實驗結果，往往需要熟練且有經驗的分析人員，因為任何錯誤或不一致都可能導致定量不準確或重做。這些錯誤或不一致包括在生成校準曲線和QC樣品時的移液錯誤、遺漏或錯誤標記的樣品、不正確的試劑添加等情況。

將自動化引入生物分析實驗室不僅有助于最小化或消除這些挑戰(zhàn)，還可以解放分析人員的雙手，使其能夠從事其他更高價值的工作。

下面小編就向大家介紹如何使用Andrew+移液機器人制備校準曲線，對QC樣品（血漿中的多種小分子藥物）進行稀釋。目標分析物包括乙酰唑胺、撲熱息痛、潑尼松、2-甲基苯甲酰胺、可的松、美托洛爾和阿米替林。然后，使用Andrew+搭配Extraction+模塊，對樣品進行全自動SPE。制備好的樣品使用LC-MS進行定量分析，獲得校準曲線結果以及重現性和回收率指標。

圖1. Andrew+搭配Extraction+ SPE新模塊，執(zhí)行自動化SPE樣品制備和LC-MS分析工作流，分別使用Oasis HLB SPE小柱和SPE萃取板。

 優(yōu)勢

使用Andrew+ Robot搭配Extraction+固相萃取新模塊，可實現標準曲線制備、QC樣品稀釋和無人值守的全自動SPE工作流；

OneLab軟件擁有簡潔直觀的用戶界面，便于用戶輕松設計和執(zhí)行各種自動化樣品制備方案，輕松實現方法創(chuàng)建和方法轉移；

1cc、3cc和6cc固相萃取小柱或96孔萃取板均可在Extraction+互聯設備上實現固相萃取；

受OneLab軟件控制的可編程的真空泵壓力曲線可提高SPE方法的重現性。

實驗方案一

制備校準曲線，樣品稀釋，使用Oasis HLB 1cc SPE小柱執(zhí)行固相萃取 

樣品進行反相固相萃取工作流：

*注意：沃特世于1996年推出Oasis HLB, 是所有Oasis吸附劑的主要成分。可耐受pH 0-14，采用獨特的水可浸潤性聚合物吸附劑，省去了活化和平衡步驟，是SPE的新標桿。

以Andrew+移液機器人進行全自動SPE為例，介紹OneLab軟件中的自動化方法，Andrew+將上圖所示的SPE步驟自動化。

圖2. 左側為OneLab的方法創(chuàng)建界面，右側為SPE工作流使用的移液槍、槍頭、Dominos和Device物料清單。

Andrew+移液機器人搭載Extraction+ SPE新模塊的儀器配置如下圖，包括：

Andrew+ Robot主機；

微孔板抓手（自動移動96孔板）；

Extraction+配套的真空泵（壓力曲線受軟件控制）；

廢液瓶（上樣和清洗產生的廢液，經真空泵抽取，進入廢液瓶）；

Extraction+配套的萃取套件（上部放置SPE小柱或萃取板，下部放置收集容器）；

放置SPE小柱或萃取板的位置（左側升降Lifter可將承載SPE小柱的架子移到左側，以便用微孔板抓手將收集容器放入下部）。

實驗結果

使用 沃特世ACQUITY UPLC I-Class液相系統搭載快速柱進行色譜分離，再用 Xevo TQ-XS串聯四極桿質譜儀對從血漿中萃取出的小分子藥物進行檢測。分析3個濃度的血漿樣品(Low QC-10 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-150 ng/mL)，回收率范圍是95.8% - 108.4%，精密度結果是幾乎所有RSD%值≤5%。這些結果滿足FDA對小分子生物分析方法驗證的推薦限值。

表1. 回收率和重現性結果 — Andrew+執(zhí)行血漿樣品制備，Extraction+搭載Oasis HLB 1cc SPE小柱執(zhí)行全自動SPE。

實驗方案二

制備校準曲線，樣品稀釋，使用Oasis HLB 30mg 萃取板執(zhí)行固相萃取 

與實驗方案一執(zhí)行同樣的反相固相萃取工作流，萃取耗材是Oasis HLB 30 mg plates。

 實驗結果

使用沃特世ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜系統搭載快速柱進行色譜分離，再用Xevo TQ-XS串聯四極桿質譜儀對從血漿中萃取出的小分子藥物進行檢測。分析3個濃度的血漿樣品(Low QC-20 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-400 ng/mL)，回收率范圍是88.6% - 110.8%，精密度結果是大多數RSD%值≤5%。這些結果滿足FDA對小分子生物分析方法驗證的推薦限值。

表2. 準確度和精密度結果 — Andrew+執(zhí)行血漿樣品制備，Extraction+搭載Oasis HLB 30 mg plates執(zhí)行全自動SPE。

毒品吸食后經人體代謝會被排入生活污水中，依據“污水流行病學”對特定區(qū)域生活污水中的毒品原藥或其代謝物含量進行檢測，再結合污水流量和污水處理廠服務區(qū)域的人口數量，就可以評估和判斷污水廠服務區(qū)內毒品濫用情況并進行層層溯源。

“污水驗毒”不僅可用于監(jiān)測城市或地區(qū)的毒品濫用情況，還可以通過監(jiān)測污水中毒品的異常情況為追查制毒窩點、打擊毒品犯罪和預警新精神活性物質等提供線索。但由于該方法屬于納克級檢測，且污水量大、基質復雜，對前處理儀器提出了很高的要求。

屹堯科技的“全自動固相萃取-液相色譜-串聯質譜同時測定污水樣品中10種常見毒品毒物的分析方法”，采用EXTRA全自動固相萃取儀進行污水樣品前處理，既可快速、GX自動連續(xù)處理大批量污水樣品，又可確保樣品分析的穩(wěn)定性和平行性。EXTRA采用高精度工業(yè)級絲桿機械臂搭載定量環(huán)進樣方式，確保樣品不進入泵閥，配合液位追蹤和流動式清洗功能，避免儀器本身帶來的交叉污染風險，對真實數據做出更精確的解讀。

全自動固相萃取-液相色譜-串聯質譜同時測定污水樣品中10種常見的毒品毒物

儀器和材料

EXTRA全自動固相萃取儀；N1全自動氮吹濃縮儀；液相色譜-串聯質譜儀（AB SCIEX Exion LC-Triple Quad 5500）；MCX陽離子交換柱（WondaSep MCX 60mg/3mL）

污水樣品前處理方法

污水樣品充分搖勻后，加入鹽酸調節(jié)pH值小于2，使用溶劑過濾器和玻璃纖維濾膜過濾，取濾液50mL于50mL 離心管中，進行固相萃取凈化。

固相萃取凈化步驟

洗脫液采用N1全自動氮吹濃縮儀在40℃條件下氮吹濃縮至近干，用250 uL 0.1%甲酸水復溶后，過濾膜上LC-MS/MS進行分析。

液質聯用條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 (100mm ×2.1 mm×1.7 μm )

流速：0.40 mL/min

柱溫：40°C

進樣量：5 μL

檢測器：AB 5500

離子模式：ESI+

流動相：A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸乙腈

洗脫梯度：

方法學驗證：

空白樣品中添加濃度為0.05 μg/L的10種毒品標準品，按照上述步驟進行操作，結果表明：10種化合物的平均回收率在88.9%~106.3%之間，RSD小于5.0%。

總結：

采用EXTRA全自動固相萃取儀配套N1全自動氮吹濃縮儀進行污水樣品前處理，可連續(xù)自動處理40個污水樣品。SPE步驟完成后無需更換試管，即可自動完成固相萃取和氮吹濃縮全過程，減少工作人員長時間接觸有毒有害溶劑，確保方法的穩(wěn)定性和平行性，避免交叉污染的同時，有效提高工作效。

固相萃取是近年發(fā)展起來一種樣品預處理技術，由液固萃取和柱液相色譜技術相結合發(fā)展而來，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更***將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，操作簡單、省時、省力。***的應用在醫(yī)藥、食品、環(huán)境、商檢、化工等領域。 萃取是利用系統中組分在溶劑中有不同的溶解度來分離混合物的單元操作，萃取有兩種方式： 液液萃取，用選定的溶劑分離液體混合物中某種成分，溶劑與被萃取的混合物液體不相溶，具有選擇性的溶解能力，而且有好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，并有小的毒性和腐蝕性。如用苯分離煤焦油中的酚；用有機溶劑分離石油餾分中的烯烴等。 固相萃取，也叫浸取，用溶劑分離固體混合物中的成分，如用水浸取甜菜中的糖類；用酒精浸取黃豆中的豆油以提高油產量；用水從中藥中浸取有效成分以制取流浸膏叫“滲瀝”或“浸瀝”。 雖然萃取經常被用在化學實驗中，但它的操作過程并不造成被萃取物質化學成分的改變（或說化學反應），所以萃取操作是一個物理過程。 萃取蒸餾是在有一種易溶、高沸點，并且不揮發(fā)的組分存在下的蒸餾，而這種溶劑本身并不與混合物中的其他組分形成恒沸物。萃取蒸餾通常用來分離一些具有很低的甚至相等的相對揮發(fā)度的物系。由于混合物中兩組分的揮發(fā)度接近相等，使到他們在接近相同的溫度下蒸發(fā)，而且蒸發(fā)的程度也相近，從而使分離變得困難。因此，相對揮發(fā)度很低的物系通常很難被簡單的蒸餾過程所分離。 萃取蒸餾使用一種一般不揮發(fā)、具有高沸點，并且易溶的溶劑與混合物混合，但卻并不與混合物中的組分形成恒沸物。這種溶劑與混合物中的各個組分發(fā)生不同的作用，令到他們的相對揮發(fā)度發(fā)生變化。從而使到他們可以在蒸餾過程中分離開來。揮發(fā)度高的組分被分離開并形成塔頂產品。塔釜產品則由溶劑和另一組分混合而成。由于溶劑并不與另一組分形成恒沸物，因此他們可以再用適合的方法分離開。 這種蒸餾方法的一個重要部分就是溶劑的選擇。溶劑在把兩組分分離開的過程中扮演著重要的角色。值得注意的是，在選擇溶劑時，溶劑需要能***改變相對揮發(fā)度，否則便會是徒勞的嘗試。同時還要注意溶劑的經濟性（需要使用的量、其本身的價格和其可用性）。還要容易在塔釜中分離開來。并且不能與各組分或混合物發(fā)生化學反應；也不能在設備中引起腐蝕。一個典型的例子 就是用苯胺或其他合適的替代品作為溶劑，萃取蒸餾苯和環(huán)己烷形成的恒沸物。 固相萃取是一種用途***而且越來越受歡迎的樣品前處理技術，它建立在傳統的液-液萃取基礎之上，結合物質相互作用的相似相溶機理和目前***應用的HPLC、 GC中的固定相基本知識逐漸發(fā)展起來的。SPE具有有機溶劑用量少、便捷、安全、高效等特點。 SPE根據其相似相溶機理可分為四種：反相SPE、正相SPE、離子交換SPE、吸附SPE。 SPE大多數用來處理液體樣品，萃取、濃縮和凈化其中的半揮發(fā)性和不揮發(fā)性化合物，也可用于固體樣品，但先處理成液體。目前國內主要應用在水中多環(huán)芳烴和多氯聯苯等有機物質分析，水果、蔬菜及食品中農藥和除草劑殘留分析，***分析，臨床***分析等方面。 SPE裝置由SPE小柱和輔件構成。SPE小柱由三部分組成，柱管、燒結墊和填料。SPE輔件一般有真空系統、真空泵、吹干裝置、惰性氣源、大容量采樣器和緩沖瓶。 一個樣品包括分離物和干擾物通過吸附劑；吸附劑選擇性的保留分離物和一些干擾物，其他干擾物通過吸附劑；用適當的溶劑淋洗吸附劑，使先前保留的干擾物選擇性的淋洗掉，分離物保留在吸附劑床上；純化、濃縮的分離物從吸附劑上淋洗下來。

1、流動相

A、流動相純度：

建議使用色譜純及以上的級別的流動相（乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1或二氯甲烷）。

B、流動相應滿足實驗過程需求

使用前，請務必要按照凝膠凈化色譜柱上的標簽規(guī)格（乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1或二氯甲烷）要求配置相應的的流動相，流動相應滿足實驗過程需求，對于柱體上標有流動相為乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1的凝膠色譜柱,流動相只能使用（乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1）,尤其是不能使用二氯甲烷作為它的流動相,否則將會對凝膠色譜柱的填料的膨脹系數造成影響,從而使得柱子不能夠有效的使用。需要使用0.45微米的濾膜過濾并超聲脫氣混合均勻。

C、流動相的用量:

由于方法中的流速為5mL/min，如果實驗樣品的數量很多，應該一次性配好流動相充足的量，避免中途在往試劑瓶里添加。否則易產生氣泡，導致基線不穩(wěn)。

2、樣品溶劑的選擇

在使用GPC時,請注意樣品溶劑對凝膠色譜柱的影響, 即，在選擇樣品溶劑時，應該選擇與流動相極性相符的溶劑，盡量使用流動相作為樣品溶劑。

3、對樣品溶液的要求

所有的樣品溶液均需過0.45微米（0.22微米）的濾膜處理，否則可能會將樣品中的固體顆粒引入電磁閥，造成電磁閥因堵塞而損壞。

4、輸液泵壓力偏高

如發(fā)現控制面板上的輸液泵壓力變大或報警停泵時，請將儀器的放空濾片座卸下來用流動相超聲清洗10~20min后，再安裝上使用。

5、在較長時間內不使用GPC凝膠系統時

請您先用對應的流動相將凝膠色譜柱沖洗10～20min，然后取下，用特有的聚四氟堵頭將其兩端封好，在下次使用時再重新安裝上，然后以其所使用的流動相沖洗十分鐘以上（使其基線達到平穩(wěn)）后，在進行使用。

6、GPC管路的清洗

若使用GPC與濃縮儀器做茶葉等顏色較深的樣品時（當回收率降低時），請每隔半個月將凝膠凈化色譜柱拆下來，用一個不銹鋼兩通替代柱子連接管路，然后把流動相換成甲醇：丙酮（1:1），沖洗管路一個小時，然后換回流動相沖洗二十分鐘，再把凝膠柱安裝上，再做實驗。

7、保護柱（預柱）的清洗

當回收率降低時，如有保護柱（預柱）的話，用甲醇：丙酮（1:1），低流速反向沖洗二十分鐘。

8、濃縮杯的清洗

當回收率降低時，查看濃縮杯是否臟污，如臟污，建議將濃縮杯取下，用濃硫酸或10%的稀硝酸清洗，再用純水洗凈吹干，再使用。

9、濃縮儀氮氣與真空壓力的調節(jié)

在使用Liqvap濃縮儀時,請將真空泵的負壓表部分的量程調到-40kpa左右,氮氣壓力表的出口量程調到0.05Mpa左右（儀器的后面也有一個小的分壓表也調到0.05Mpa左右，SPE 與之相同，小的分壓表也調到0.05Mpa左右）.(一般在工程師安裝調試完成后,則不需要客戶再做其他的操作)。

10、及時關閉輸液泵

實驗結束后，請點擊工作站左側下方的【手動操作】按鈕，選擇【GPC信息】項，點擊【輸液泵】中的【停止】按鈕，將輸液泵關閉后，再關閉工作站，然后分別將儀器及電腦的電源關閉。

11、避免燙傷

在使用過程中，請勿用手觸碰濃縮儀的加熱外壁，以免將手燙傷。

12、及時傾倒廢液

請注意及時處理廢液瓶，以避免廢液過滿而流出所造成的污染。

13、SPE管路的填充

請在儀器運行之前，對相應的管路進行填充排氣操作；方法為：手動控制中，選中“注射器”下方的“溶劑類型”中的“Solvent-1”等，然后點擊【所有通道】各兩次，再點擊“清洗”欄下的【進樣針】二次【注意！不能連續(xù)點擊，只能是一次一次的操作】。（更換溶劑或方法、長時間不用儀器時操作此步）【注：具體情況根據方法中使用幾種溶劑，比如方法中只含有兩種溶劑，只填充對應通道即可?！?/p>

14、固相萃取小柱的選擇與擺放

在使用過程中，請在運行前選擇相應類型（1mL、3mL和6mL）。切記不可在同一批表下運行不同類型的固相萃取小柱。并按批表的設置，擺放好對應的固相萃取小柱。

15、自動液體處理器的維護

請您在使用過程中不要隨便移動、變更樣品盤上的樣品架，因為該位置在安裝時已經調整好，移動、變更樣品盤上的樣品架，將可能會發(fā)生進樣針折斷等事故。在實驗結束以后，請盡可能的對其做一些防塵措施，以便延長其使用的壽命。

1 壓力確認

每次運行方法前，請做好準備工作，檢查氮氣瓶總壓力0.5Mpa，溶劑表的壓力設置為0.1 Mpa，樣品的壓力設置為0.05 Mpa左右；壓力調節(jié)時若要調低壓力請降低后再增大到你要降低的那個壓力，保證是朝同一個方向調，因為壓力表在泄壓時有個過程看著壓力降到了，但一段時間后壓力會更低，所以降低后再反轉，大體積時根據臟污程度和流速在0.03-0.1之間調節(jié)，說明書后面附錄有不同壓力下對應的大致流速，客戶可參考。

2 溶劑確認與設值

實驗前，要先檢查溶劑是否充足，因為儀器是正壓上樣，所以溶劑要準備的充足。同時，在使用前，請注意設置PC通訊和溶劑設置兩項。一定要在方法設置之前，先設置好溶劑名稱，否則將不能正常編輯方法。

3 收集架的設置

Sepaths的收集架是兩排，可實現分布收集，在擺放收集管時需注意，里面是1號位，也是默認位置，外面是2號位。

4 大小體積的切換

實驗過程中，需注意在編輯方法時，注意上揚的體積，體積小于25ml時，使用小體積適配時，在編輯方法時要注意將淋洗、洗脫的體積類型設置。

5 柱塞清洗

柱塞在使用前和使用后必須馬上用乙醇進行清洗。

6 其他

樣品瓶管口應轉向低的一側，同時確認萃取柱接頭有沒有安裝好，收集架裝好沒有，廢液管準備好沒有。

以上為本機操作和簡明維護說明，更詳細的說明請參閱本機使用說明書或致電本公司客戶服務ZX。

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