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  敏姐是個好人0 2017-03-20 00:00:00

  蛋白質(zhì)沉淀的定義： 蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)，變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。 蛋白質(zhì)沉淀的方法： 鹽析法 ——多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化； 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對混和蛋白質(zhì)組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。鹽析法分為兩類，diyi類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現(xiàn)，用于后期進一步分離純化和結(jié)晶。影響鹽析的因素包括：蛋白質(zhì)濃度、離子強度和類型、PH值、溫度等。針對溫度這一條，需要強調(diào)：在低離子強度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-四℃進行。 使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H二S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H二S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，一00℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。 有機溶劑沉淀法 ——多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化； 有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，Z后析出。該法優(yōu)點在于：一）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；二）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；三）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。但是，在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。因此，操作要求在低溫下進行。有機溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和二-甲基-二，四戊二醇等。 等電點沉淀法 ——此法單獨應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用； 兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度Z低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎(chǔ)可進行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時，在粗提液中先調(diào)PH吧.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)PH三.0去除酸性蛋白質(zhì)。利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整PH值。等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。 重金屬鹽沉淀法 ——常用于搶救誤服重金屬鹽中毒的病人； 許多有機物質(zhì)包括蛋白在內(nèi)，在堿性溶液中帶負電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據(jù)有機物與它們之間的作用機制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類，如銅鋅鎘；親羧酸疏含氮化合物類，如鈣鎂鉛；親硫氫基化合物類，如汞銀鉛。蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物的重要性質(zhì)是它們的溶解度對溶液的介電常數(shù)非常敏感，調(diào)整水溶液的介電常數(shù)（如加入有機溶劑），即可沉淀多種蛋白。沉淀的條件以pH稍大于等電點為宜。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的，但若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。臨床上利用蛋白質(zhì)能與重金屬鹽結(jié)合的這種性質(zhì)，搶救誤服重金屬鹽中毒的病人，給病人口服大量蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來

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