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生物學(xué)離心方法

*星小可愛 2009-06-29 14:55:34 602  瀏覽
  • 生物學(xué)所用到的離心方法有哪幾種?如:差速離心等。請詳細(xì)介紹

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  • 儲韶文3112 2009-06-30 00:00:00
    還有密度梯度離心。。。

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  • 兩只小蜜蜂YU 2017-11-21 20:15:09
    1.差速離心(differential centrifugation) 依據(jù)實際物系特點(目的物和其他組分性質(zhì)和相互作用等)、分離目的和分離所需程度,調(diào)整離心力和時間,使得不同組分得以分離。 2.區(qū)帶離心(zonal centrifugation) 區(qū)帶離心又分為:差速區(qū)帶離心和平衡區(qū)帶離心. 其中 差速區(qū)帶離心:物質(zhì)密度大于密度梯度Z大密度 平衡區(qū)帶離心:物質(zhì)密度小于密度梯度Z大密度 具體例子記得學(xué)分離工程的時候課本上好像有,記不太清了,希望能幫到你。

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  • 神Yk0情4y六0 2016-02-06 16:05:26
    1. 差速沉降離心法: 這是Z普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心,使沉降速度不同的顆粒,在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。 差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進(jìn)行離心時,在離心管底部就會得到Z大和Z重顆粒的沉淀,分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心,又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液,如此多次離心處理,即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的,仍雜有其它成分,需經(jīng)過2~3次的再懸浮和再離心,才能得到較純的顆粒。 此法主要由于組織勻漿液中分離細(xì)胞器和病毒,其優(yōu)點是:操作簡易,離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開,并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是:須多次離心,沉淀中有夾帶,分離效果差,不能一次得到純顆粒,沉淀于管底的顆粒受擠壓,容易變性失活。 2. 密度梯度區(qū)帶離心法(簡稱區(qū)帶離心法): 區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡,在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法。 此法的優(yōu)點是:①分離效果好,可一次獲得較純顆粒;②適應(yīng)范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒;③顆粒不會擠壓變形,能保持顆?;钚?,并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。 此法的缺點是:①離心時間較長;②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液;③操作嚴(yán)格,不易掌握。 密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種: (1)差速區(qū)帶離心法:當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差)。在一定的離心力作用下,顆粒各自以一定的速度沉降,在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒(20% 的沉降系數(shù)差或更少)或分子量相差3倍的蛋白質(zhì),與顆粒的密度無關(guān),大小相同,密度不同的顆粒(如線粒體,溶酶體等)不能用此法分離。 離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液,樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上,離心時,由于離心力的作用,顆粒離開原樣品層,按不同沉降速度向管底沉降,離心一定時間后,沉降的顆粒逐漸分開,Z后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶,沉降系數(shù)越大,往下沉降越快,所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低,離心必須在沉降Z快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束,樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液,其Z大密度和濃度可達(dá)1.28 kg/cm3和60%。 此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時間 。 (2)等密度區(qū)帶離心法:離心管中預(yù)先放置好梯度介質(zhì),樣品加在梯度液面上,或樣品預(yù)先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管,通過離心形成梯度,這就是預(yù)形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。 離心時,樣品的不同顆粒向上浮起,一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上,形成幾條不同的區(qū)帶,這就是等密度離心法。體系到達(dá)平衡狀態(tài)后,再延長離心時間和提高轉(zhuǎn)速已無意義,處于等密度點上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時間所影響,提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時間,離心所需時間以Z小顆粒到達(dá)等密度點(即平衡點)的時間為基準(zhǔn),有時長達(dá)數(shù)日。 等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒大小和形狀無關(guān),但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時間和區(qū)帶寬度。 等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl,其密度可達(dá)1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等,也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì),但簡單蛋白質(zhì)不適用。 收集區(qū)帶的方法有許多種,例如: (1) 用注射器和滴管由離心管上部吸出。 (2) 有針刺穿離心管底部滴出。 (3) 用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁,把樣品區(qū)帶抽出。 (4)用一根細(xì)管插入離心管底,泵入超過梯度介質(zhì)Z大密度的取代液,將樣品和梯度介質(zhì)壓出,用自動部分收集器收集。

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根據(jù)NCBI的ClinVar數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計,包括罕見疾病,如鐮狀細(xì)胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異(SNV)有關(guān),SNV可能導(dǎo)致原始DNA序列、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術(shù)——堿基編輯器(BEs)可以有效地修復(fù)堿基突變,而不會誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂,從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變,對于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經(jīng)報道的有誘導(dǎo)C·G到T·A轉(zhuǎn)化的胞嘧啶堿基編輯器(CBE)、誘導(dǎo)A·T到G·C轉(zhuǎn)化的腺嘌呤堿基編輯器(ABE)和使C·G到G·C轉(zhuǎn)換的糖基化酶堿基編輯器(GBE),這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。


然而,在實施基于BE的基因療法之前,有必要大量構(gòu)建具有致病性SNV的細(xì)胞疾病模型,以用于開發(fā)和優(yōu)化BEs,并使其在基因治 療中的應(yīng)用成為可能。同時,根據(jù)ClinVar的數(shù)據(jù),大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉(zhuǎn)化,然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細(xì)胞模型。這一方面是由于大規(guī)模樣品,手動操作不僅耗時,而且容易出錯,一致性較差且成本高昂;另外一方面,現(xiàn)有的基于目標(biāo)-位點集成庫的方法,如Be-Hive等在為AI學(xué)習(xí)和預(yù)測編輯性能的數(shù)據(jù)時,缺乏原位信息的綜合編輯位點數(shù)據(jù),同時又缺少真實染色體環(huán)境(先前研究表明,核酸酶的性能與染色質(zhì)可及性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性,并且基因編輯在真核染色質(zhì)中比異染色質(zhì)中更有效)。


中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所和天津科技大學(xué)的團(tuán)隊,開發(fā)了一個由以下四個模塊組成的用于哺乳動物細(xì)胞高通量原位基因編輯的自動化平臺,實現(xiàn)了哺乳動物細(xì)胞基因編輯的標(biāo)準(zhǔn)化和可拓展性。


(1)內(nèi)源性靶g(shù)RNA計算機(jī)輔助設(shè)計;

(2)gRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建;

(3)哺乳動物細(xì)胞堿基編輯;

(4)CBEs性能模型構(gòu)建的機(jī)器學(xué)習(xí)。


四個模塊組成的用于哺乳動物細(xì)胞高通量原位基因編輯的自動化平臺,實現(xiàn)了哺乳動物細(xì)胞基因編輯的標(biāo)準(zhǔn)化和可拓展性。該平臺借助大規(guī)模的原位編輯數(shù)據(jù)和序列信息,結(jié)合局部染色質(zhì)可及性,具有原位數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型能夠更好地預(yù)測實際的堿基編輯效率,使獲得內(nèi)生目標(biāo)的大規(guī)模編輯數(shù)據(jù)集成為可能。


圖1 全自動高通量哺乳動物基因編輯平臺概覽


在這四個模塊中,第 一個模塊用于負(fù)責(zé)gRNA設(shè)計,以將人類致病性SNV引入野生型細(xì)胞,作者使用生物信息學(xué)分析選擇了1210個基因作為靶位點,使用包含每個靶位點上游3 bp至下游750 bp靶區(qū)的DNA序列,分批處理用于分析編輯結(jié)果的三對引物。對于自動化gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程模塊,gRNAs質(zhì)粒構(gòu)建過程中采用了貝克曼庫爾特Echo納升級聲波移液系統(tǒng)用于操縱DNA組裝反應(yīng),相對于標(biāo)準(zhǔn)的Golden Gate DNA組裝方法的反應(yīng)體積為15μl,Echo的納升級和無吸頭操作能夠?qū)嶒灢襟E進(jìn)行一系列優(yōu)化,將反應(yīng)系統(tǒng)最小化到1微升的總體積,從而顯著降低了實驗成本。


隨后使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站將DH5α感受態(tài)細(xì)胞與Golden Gate產(chǎn)物進(jìn)行混合,通過ClonePix進(jìn)行轉(zhuǎn)化鋪板,并在通過DNA測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒之后,使用Biomek i7進(jìn)行質(zhì)粒提取。為了分析數(shù)據(jù)編輯結(jié)果,使用Python腳本讀取sanger測序文件,比較N20,并創(chuàng)建兩個參考csv文件。錯誤的組裝csv文件包括一個選擇列表,用于從48孔細(xì)菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落,以便ClonePix進(jìn)行另一輪驗證。正確組裝csv文件包含N20測序及其在96孔深孔板中的位置,用于使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站進(jìn)行質(zhì)粒提取。此模塊高通量自動化系統(tǒng)在4天之內(nèi)共構(gòu)建和分析了1210個gRNA質(zhì)粒,成功率達(dá)99%,實現(xiàn)了每天384個gRNA組裝的通量。而后續(xù)使用Biomek i7進(jìn)行的質(zhì)粒提取,通量則可達(dá)到576個質(zhì)粒/天。


圖2 全自動gRNA質(zhì)粒構(gòu)建工作流程概述示意圖

第三個模塊是哺乳動物細(xì)胞中的堿基編輯,如圖3。通過優(yōu)化實驗條件,作者開發(fā)了使用Biomek i7自動化移液工作站進(jìn)行包括細(xì)胞接種和轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)基更換以及進(jìn)行樣品收集在內(nèi)的編輯過程。隨后進(jìn)行靶區(qū)域的細(xì)胞裂解和PCR擴(kuò)增。全自動高通量系統(tǒng)在6h內(nèi)將1210組gRNA和BE4max質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,并在2 h內(nèi)完成后續(xù)培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)5天后,收獲編輯的細(xì)胞于8小時內(nèi)完成進(jìn)行PCR分析,然后進(jìn)行sanger測序。使用Python腳本產(chǎn)生3個csv文件,一個用于準(zhǔn)備新一輪PCR的挑選列表,以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample;第二個csv文件包含用于分析false sample的第二個引物對的序列和位置信息,用于新一輪PCR;第三個csv文件包含正確的樣本和編輯效率結(jié)果,用于下一步的AI學(xué)習(xí)。


圖3 自動化基因編輯過程的工作流程概述


第四個模塊為作者開發(fā)的AI模型——染色質(zhì)可及性學(xué)習(xí)模型(CAELM),預(yù)測基礎(chǔ)編輯的結(jié)果。CAELM基于自動化平臺生成的高度均勻的原位基因組編輯數(shù)據(jù),預(yù)測HEK4T細(xì)胞中的BE293max行為,并實現(xiàn)了0.64的皮爾遜相關(guān)值。皮爾遜r是評估數(shù)值數(shù)據(jù)模型準(zhǔn)確性的最普遍指標(biāo)之一,CAELM模型中考慮了目標(biāo)序列的真實染色體環(huán)境,這提供了更好、更現(xiàn)實的預(yù)測;同時,CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分,并揭示了DNA可及性相對于目標(biāo)序列上下文的貢獻(xiàn)在預(yù)測中接近1:6。


通過與32個不同基因組位點的手動操作進(jìn)行比較,其中16個目標(biāo)位點在兩個操作過程中的編輯效率幾乎相等,而自動化高通量系統(tǒng)在其他14個位點的統(tǒng)計分析中表現(xiàn)出更高的編輯效率。這些結(jié)果表明,自動化高通量系統(tǒng)能夠以與手動操作相當(dāng)?shù)男蕡?zhí)行基礎(chǔ)編輯;隨機(jī)選擇BE4max編輯靶標(biāo)的1210個與疾病相關(guān)的SNV的編輯效率均達(dá)到了較高水平,說明可以同時有效地操縱數(shù)千個內(nèi)源性靶位點的人類細(xì)胞的全自動高通量原位基因編輯平臺的成功建立。



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離心機(jī)的那些事兒,實驗室常見離心方法有哪些?

細(xì)胞離心是常見細(xì)胞實驗中不可缺少的一步,它不僅可以使掛壁的樣品完全沉降到管底,也可以幫助確認(rèn)細(xì)胞濃度,用于后續(xù)的如原代細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞傳代培養(yǎng)、單細(xì)胞測序等相關(guān)實驗。


對于不同的細(xì)胞/細(xì)胞器分離,其離心分離法各不相同,適合的場合也不盡相同。那么常見的細(xì)胞離心分離方法都有哪些呢?


01差速離心法

差速離心法是利用在離心力場中不同的粒子沉降系數(shù)的差別,通過逐漸提高離心力,使非均勻混合液內(nèi)的不同大小、形狀的粒子分步沉淀的離心方法。主要用于實驗室樣品分離,例如分離細(xì)胞器線粒體、葉綠體、蛋白質(zhì)和病毒等。

 分離步驟 第/一步:設(shè)置較低的離心速度(相對離心力),先讓較大的顆粒沉降到管底,而混合液中小的顆粒仍然懸浮在上清液中。

第二步:收集沉淀,設(shè)置較高的離心速度(相對離心力)離心懸浮液,將較小的顆粒沉降,后續(xù)依此類推,最終可分離不同大小顆粒的。

圖一.差速離心示意圖


 02密度梯度離心法

密度梯度離心法又稱為區(qū)帶離心法,可分為速率區(qū)帶離心法等密度離心法。

 1.速率區(qū)帶離心法 

主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。離心管內(nèi)先裝入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介質(zhì),樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點的密度,被分離的粒子在梯度液中沉降速度不同,離心時,混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶,達(dá)到彼此分離的目的。

圖二.速率區(qū)帶離心示意圖


 2.等密度離心法 

適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達(dá)到平衡,從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。常用介質(zhì)有Percoll,而CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺經(jīng)長時間離心后也可產(chǎn)生穩(wěn)定的梯度。

圖三.密度梯度離心示意圖



瑞沃德M1416R高速臺式冷凍離心機(jī)

瑞沃德M1416R高速臺式冷凍離心機(jī),不僅可以應(yīng)用在細(xì)胞的密度梯度離心,還可應(yīng)用在細(xì)胞沉淀,細(xì)胞的懸浮純化;病毒的沉淀及PEG沉淀,病毒的密度梯度離心;蛋白質(zhì)、核酸分離;生物制品、化學(xué)高分子制品、納米材料純化處理;臨床的血液、體液、排泄物等的分離。應(yīng)用廣泛,性能卓越。

  • 轉(zhuǎn)速可達(dá)30,000 X g,在較高轉(zhuǎn)速也可使樣品穩(wěn)定離心

  • 9/10升降速可調(diào)節(jié),有利于密度梯度離心

  • 多種轉(zhuǎn)子可選,可實現(xiàn)單管2mL-400mL的離心需求

  • 自鎖轉(zhuǎn)子搭配快鎖蓋子,實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)自切換及離心

  • 搭配動平衡實時監(jiān)測系統(tǒng),保證樣本安全



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2017-10-28 23:29:23 1379 1
腫瘤疫苗生物學(xué)活性評估

腫瘤疫苗背景

腫瘤疫苗,是一種具有預(yù)防和治 療潛力的有吸引力的替代免疫治 療選擇,是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen,TAA)或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達(dá)的惡性細(xì)胞,并由于免疫記憶而實現(xiàn)慢性治 療反應(yīng)。因此,與其他免疫療法相比,癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治 療。


根據(jù)腫瘤抗原的組分,癌癥疫苗大致可以分為四種類型:基于 DNA 的疫苗,基于 RNA 的疫苗,基于多肽的疫苗和基于免疫細(xì)胞的疫苗。FDA 批準(zhǔn)的首 個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細(xì)胞的疫苗,用于激素難治性前列腺癌的治 療。除此之外,Moderna,BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。



圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖


腫瘤疫苗有效性評估方法

生物體接種疫苗后,腫瘤抗原被帶到淋巴結(jié),進(jìn)而激活抗原特異性的 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞,活化的 B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體及活化的效應(yīng) T 細(xì)胞會使腫瘤內(nèi)脹并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。


圖 2 腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)示意圖


如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題,常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法,包括細(xì)胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細(xì)胞活化標(biāo)志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。


1、細(xì)胞因子檢測

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞經(jīng)過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質(zhì),在免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用,因此可以通過細(xì)胞因子的分泌能力來反應(yīng)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的水平。常見的細(xì)胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。



ELISA 是一種非常經(jīng)典的細(xì)胞因子的檢測方法,例如在王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中,提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨 髓源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)分泌細(xì)胞因子的能力,檢測方法如下:


BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃下培養(yǎng) 6 天,然后以每孔 5×104 細(xì)胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最 終濃度加入疫苗抗原,孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養(yǎng)上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜,然后在室溫下依次加入阻斷液、細(xì)胞培養(yǎng)上清和檢測抗體,孵育 1h 。 最 后加入終止液和顯色劑,用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。


檢測結(jié)果如下:

從檢測結(jié)果可以看出,T7(TLR7 激動劑)的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。



圖 3 ELISA 法測定小鼠骨 髓樹突狀細(xì)胞 (BMDCs) 分泌

TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平


Ankita Leekha 等人發(fā)表的關(guān)于 SRAS-COV2 疫苗文章中,提到了用 ELISPOT 的方法評估細(xì)胞因子的分泌水平,可以作為參考。具體方法如下:


從小鼠中分離脾細(xì)胞和肺細(xì)胞,使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎(chǔ)試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進(jìn)行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下,在預(yù)包被抗體的 ELISpot 板中,用抗原刺激脾細(xì)胞和肺細(xì)胞,培養(yǎng) 16-18 小時。第二天,洗掉細(xì)胞,加入生物素化的檢測抗體。洗板后,加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯(lián)物,室溫孵育 1 小時。洗板后,每孔添加 70μL 顯色液,孵育 20-30min,形成斑點,然后用水清洗,干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進(jìn)行量化。每個點對應(yīng)一個單獨的細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。


檢測結(jié)果如下:



圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細(xì)胞

和肺細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平


2、CTL 活性檢測

疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,起到抗腫瘤的作用,因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應(yīng)來反應(yīng)疫苗的效果。常用的檢測細(xì)殺傷效應(yīng)的方法有很多,下表列舉了一些常用的方法。



王曉東等人發(fā)表的文章中提到了 LDH 檢測,檢測方法如下:


從接種疫苗小鼠的脾 臟中分離淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)。EAC 腫瘤細(xì)胞(靶細(xì)胞)與淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞比例為 50:1)共培養(yǎng) 4h,使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細(xì)胞毒性。將培養(yǎng) 4h 后的培養(yǎng)上清加入在 ELISA 板中,室溫下加入底物溶液,孵育 30min。最 后,加入終止液終止反應(yīng),并用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。


檢測結(jié)果如下:

相對于 PBS 對照組來說,T7-MB 組 CTL 細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)。


圖 5 LDH 法測定 CTL 介導(dǎo)的 EAC 靶細(xì)胞的裂解水平


3、抗體滴度及親和力檢測

腫瘤疫苗除了可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫之外,也可誘導(dǎo)體液免疫,對此可通過對抗體滴度及親和力進(jìn)行檢測來反應(yīng)疫苗抗腫瘤的效果,ELISA 是一種非常經(jīng)典的檢測方法。


上述關(guān)于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量,具體檢測過程如下:


小鼠接種疫苗后收集血液樣本,通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預(yù)先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜,然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h,血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最 后,在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液,用酶標(biāo)儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。


檢測結(jié)果如下:

相對于 PBS 對照組來說,T7-MB 組抗體含量明顯上升。


圖6 ELISA法測定疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平


除此之外,在 Emily C. Gale 等人發(fā)表的關(guān)于 mRNA 遞送系統(tǒng)及輔劑研究的文章中,通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體的絕 對含量及其親和力。具體檢測方法如下:


抗體濃度:小鼠接種加強(qiáng)疫苗后,采集血液樣品,血清按照 1:100 000 進(jìn)行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑,按照試劑廠家的說明進(jìn)行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清抗體濃度,表示 mg/mL。


抗體親和性:將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標(biāo)記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合,并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時,洗板后用 TMB 底物孵育,用 HCl 停止反應(yīng)。測定 450nm 處的 OD 值。根據(jù)業(yè)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體的共同親和力,假設(shè)對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進(jìn)行統(tǒng)計。這一假設(shè)僅影響報告的絕 對 KD 值,而不影響實驗組之間的相對差異。


檢測結(jié)果如下:

pIC 為雙鏈 RNA 結(jié)構(gòu)模擬物,圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的絕 對抗體含量,從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統(tǒng)誘導(dǎo)的 OVA 特異性抗體含量最 高。從F和G可以看出 2B 遞送系統(tǒng)相對于可溶性 pIC 來說誘導(dǎo)的 IgG 親和力也顯著升高。



圖 7 pIC/PBAE NPs 增強(qiáng)體液免疫


4、ADCC 檢測

疫苗誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生的抗體能夠捕捉目標(biāo)抗原,阻斷這個靶分子的功能,也可以引導(dǎo)其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)殺死表達(dá)抗原的靶細(xì)胞,在腫瘤治 療中,特別是血液腫瘤中,抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 (ADCC) 起著關(guān)鍵作用,ADCC 常用的檢測方法包括細(xì)胞活力檢測、LDH 檢測、工程細(xì)胞株、Delfia、RTCA、細(xì)胞成像檢測等。


王曉東等人發(fā)表的關(guān)于胃癌疫苗研究的文章中,提到了 LDH 方法檢測 ADCC,檢測方法如下:


小鼠接種疫苗后,采集其血清樣本(1:25 稀釋),然后與 EAC 細(xì)胞(靶細(xì)胞)在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細(xì)胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞),與抗體標(biāo)記的 EAC 細(xì)胞以效靶比 50:1 共培養(yǎng) 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細(xì)胞毒性,檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。


檢測結(jié)果如下:

相對于 PBS 對照組來說,T7-MB 組產(chǎn)生的抗體具有顯著的殺傷效應(yīng)。


圖 8 LDH 法測定血清抗體介導(dǎo)的 EAC 靶細(xì)胞的裂解水平


腫瘤疫苗生物學(xué)活性檢測解決方案推薦


本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法,包括細(xì)胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法,涉及到了酶標(biāo)儀、成像系統(tǒng)、流式、RTCA、洗板分液系統(tǒng)等設(shè)備。Agilent 細(xì)胞分析事業(yè)部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理,到結(jié)果檢測再到數(shù)據(jù)分析的全面解決方案。



2023-02-15 14:27:47 364 0

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