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  towerrt 2016-12-20 00:00:00

  PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。PCR擴(kuò)增儀在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于—個復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個數(shù)量級，再用探針雜交探測對被擴(kuò)增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。PCR技術(shù)常與其他技術(shù)結(jié)合起來使用，如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。類別聽語音競爭性PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。將PCR技術(shù)和限制酶切技術(shù)結(jié)合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對酶切產(chǎn)物的分析，探測該基因的多態(tài)性。RAPD(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)也是應(yīng)用比較廣泛的一項技術(shù)。RAPD是用那些對某—特定基因的非特異性的引物來擴(kuò)增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應(yīng)器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內(nèi)微生物種群的變化以及比較小試規(guī)模和中試規(guī)模的反應(yīng)器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。步驟聽語音PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

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