導讀

盡管各國衛(wèi)生系統(tǒng)發(fā)展迅速，但由病原菌引起的傳染病仍然是人類健康的主要威脅之一。據(jù)報道，全世界每年有220多萬人死于水傳播大腸桿菌病原體。盡管大多數(shù)大腸菌群是無害的，但某些大腸桿菌的存在可能會導致甚至威脅到人類健康，例如，大腸桿菌O157:H7和其他產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常見因素，可能對健康造成嚴重后果，尤其是對幼兒。因此，檢測大腸桿菌對于生物醫(yī)學應(yīng)用以及食品、水和空氣質(zhì)量監(jiān)測非常重要。

大連理工大學環(huán)境科學與技術(shù)學院，工業(yè)生態(tài)學與環(huán)境工程教育部重點實驗室的科學家，開發(fā)出基于naica?全自動微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單細菌檢測方法，該方法可以在1.5小時內(nèi)以單細胞靈敏度選擇性檢測臨床尿液樣本中的大腸桿菌 。該方法發(fā)表在《Analytical Methods》，題為“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。

應(yīng)用亮點：

?  dDRCA系統(tǒng)，能夠快速、選擇性地檢測具有單細胞敏感性的大腸桿菌 ，dDRCA系統(tǒng)的檢測靈敏度比之前報道的PAD高1000倍。

? 證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染診斷中的潛在臨床適用性，dDRCA能夠在不到1.5小時內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時。

文中采用naica??全自動微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)液滴微流控技術(shù)，快速精準的檢測到復(fù)雜樣本和高背景樣本中的致病大腸桿菌。

通常擴增需要約4小時進行定量大腸桿菌檢測。在這項研究中，我們描述了DNA酶偶聯(lián)滾圈擴增（RCA），這是一種高效的等溫酶DNA復(fù)制過程，可在naica??全自動微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進行，以建立液滴DNA酶偶聯(lián)RCA（表示為dDRCA）系統(tǒng)。我們進一步證明，該系統(tǒng)能夠在1.5小時內(nèi)以單細胞敏感性選擇性檢測臨床尿液樣本中的大腸桿菌。

▲圖2（a）通過瓊脂糖凝膠電泳分析RCA產(chǎn)物（RP）。（b） 反應(yīng)混合物在指示反應(yīng)條件下的熒光響應(yīng)：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line);  RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line);  RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line); + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3閱讀器圖像（左）、CLSM圖像（中）和熒光顯微鏡圖像（右）為微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反應(yīng)條件下dDRCA系統(tǒng)的熒光圖像和熒光滴數(shù)：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli;（e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli; (f) -RFD-EC1/+ RDS/  E. coli; (g) + RFD-EC1/+ RDS/  E. coli.

使用Naica Prism3閱讀器對生成的熒光液滴進行成像和分析。dDRCA系統(tǒng)能夠在75分鐘內(nèi)選擇性計數(shù)具有單細胞敏感性的大腸桿菌，包括20分鐘的細胞裂解時間、12分鐘的液滴生成時間和43分鐘的液滴反應(yīng)時間。

通過比較其他三種常見細菌，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli）存在時的信號反應(yīng)，也檢查了dDRCA檢測大腸桿菌的選擇性。當用緩沖液或尿液中的這些意外靶點測試每個dDRCA系統(tǒng)時，未觀察到明顯的熒光液滴（圖4c和S4?）。

▲圖4（a）不同大腸桿菌濃度（每毫升細胞數(shù)）下dDRCA反應(yīng)的熒光圖像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同濃度下計數(shù)的液滴數(shù)與大腸桿菌之間的關(guān)系。提供了計數(shù)的液滴數(shù)量，插圖顯示了1–104大腸桿菌范圍內(nèi)的線性反應(yīng)。誤差條代表三個獨立實驗的標準偏差。（c） dDRCA的特異性。

最終證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染（UTI）診斷中的潛在臨床適用性。分析了20份患者和健康獻血者的臨床尿樣。整個操作程序包括：（1）細胞收集和裂解（25分鐘）；（2） 液滴生成（12分鐘）；（3） 液滴反應(yīng)（43分鐘）。如圖5c所示，五個尿樣，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿樣產(chǎn)生大量熒光液滴（>3000）。使用傳統(tǒng)的大腸桿菌培養(yǎng)方法進一步確認了這些有無大腸桿菌感染的樣本（圖5d）。因此，對UTI的診斷有很大的希望。

▲圖5（a）檢測尿液樣本中的大腸桿菌。（b） 顯示尿液樣本中計數(shù)數(shù)與大腸桿菌細胞在1-104范圍內(nèi)的線性相關(guān)性的曲線圖。（c） 20份臨床尿液樣本中陽性液滴的數(shù)量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖電解質(zhì)缺乏）瓊脂細菌尿液培養(yǎng)板。黃色菌落代表大腸桿菌在37℃的CLED瓊脂中培養(yǎng)22小時后的生長。

該系統(tǒng)能夠在不到1.5小時的分析時間內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。

導讀

反芻動物是指具有反芻習性的一類哺乳動物，如牛、羊、長頸鹿、兔子等。反芻動物采食一般比較匆忙，大部分未經(jīng)充分咀嚼就吞咽進入瘤胃，經(jīng)過瘤胃浸泡和軟化一段時間后，食物經(jīng)逆嘔重新回到口腔，經(jīng)過再咀嚼混入唾液并再吞咽進入瘤胃，這種行為稱為反芻行為。反芻動物的食物種類比其他種類的動物更豐富，結(jié)構(gòu)組成也更復(fù)雜，但草料中的粗纖維含量較高導致其難以消化，反芻動物依賴于胃部微生物群的代謝能力來消化各種物質(zhì)，但其轉(zhuǎn)化效率低也是養(yǎng)殖業(yè)廣泛關(guān)注的問題。

雖然已有研究證明瘤胃中不同微生物的活性可以調(diào)節(jié)宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物卻很少受到關(guān)注。奧地利維也納獸醫(yī)大學的Cameron等人在Research Square在線發(fā)表了題為《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究論文。文章采用多重數(shù)字PCR（dPCR）量化同一菌科的兩種菌群，分析反芻動物瘤胃上的定植菌群分布及生物進化動態(tài)，為今后畜牧業(yè)提高動物代謝能力的研究提供了新思路。

應(yīng)用亮點：

?  宏基因組測序發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮細胞中彎曲桿菌科兩個種群的基因序列高度相似，利用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以對兩個種群進行精準量化。

? 使用不同培養(yǎng)添加物后，可以利用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進行微生物種群分布跟蹤。

研究成果：

作者通過對瘤胃上皮微生物組的16S rRNA擴增子分析發(fā)現(xiàn)了一個優(yōu)勢菌株（OTU）為彎曲桿菌科（Campylobacteraceae），并通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)該OTU兩個主要種群Ca. C. stinkeris與Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白質(zhì)糖基化）操縱子不同。

為了探究Ca. C. stinkeris與Ca. C. noahi兩個種群空間分布的差異，作者通過naica^?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)比較了這兩個種群在不同動物瘤胃乳突離上皮壁最近和最遠兩個位置的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同動物的兩個種群在這兩個位置的比例接近。

▲圖1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在動物瘤胃乳突頂端和隱窩的含量比例。A）從乳突切片兩個位置提取DNA使用dPCR進行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在動物瘤胃乳突兩個位置的含量比例。橫坐標為取樣動物的名字。

然后作者使用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對兩種菌群進行生長和適應(yīng)性測定，數(shù)據(jù)顯示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸鹽為主要碳源時積累的生物量，更好地生長，但被丙酸鹽抑制，而Ca. C. noahiz在任何一種添加物存在的情況下在都沒有檢測到生長優(yōu)勢。因此，作者推斷可能存在一些其他機制來最小化競爭，這種機制通過某些代謝生態(tài)位維度上的分化，防止它們生長動力學的重疊來支持兩個種群的共存。

▲圖2 醋酸鹽利用和丙酸鹽抗性檢測。A)通過種群特異性dPCR，評估添加5 mM醋酸鹽（acetate）或丙酸鹽（propionate）對生物量積累的影響。分別用單個菌株(左，單一培養(yǎng))和競爭菌株(右，共培養(yǎng))進行了實驗。

通過數(shù)字PCR這種定量技術(shù)，作者發(fā)現(xiàn)在瘤胃乳突的頂端和隱窩都分布有這兩種優(yōu)勢菌群，且與上皮細胞分布數(shù)目無顯著的相關(guān)性。另外，這兩種菌群能夠促進相關(guān)脂肪酸的代謝，進而發(fā)揮促進食物消化的功能。該文章為通過調(diào)節(jié)反芻動物體內(nèi)某些鹽離子濃度來調(diào)節(jié)優(yōu)勢菌群的分布比例進而提升消化能力提供了思路。

導讀

在過去的幾十年中，糖尿病的發(fā)病率在顯著增長。除了不健康的生活方式外，環(huán)境污染物被認為是糖尿病發(fā)生的危險因素。多環(huán)芳烴 (PAH)是一類含有2-7個芳環(huán)的有機化合物，由自然和人類活動產(chǎn)生并廣泛存在的污染物。流行病學研究表明，PAHs水平與成人和兒童的肥胖和二型糖尿病相關(guān)。

廈門大學生命科學學院細胞應(yīng)激生物學國家重點實驗室的研究人員在Ecotoxicology and Environmental Safety上發(fā)表了題為《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中應(yīng)用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對胰島素編碼基因DNA甲基化水平進行量化，揭示了產(chǎn)前暴露于多環(huán)芳烴混合物對成年雄性小鼠胰島細胞功能的不良影響。

應(yīng)用亮點：

?  使用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對胰島素編碼基因啟動子甲基化水平進行量化。

? 在產(chǎn)前暴露于500μg/kg PAHs的小鼠中，胰島素編碼基因啟動子的甲基化水平顯著升高。

? 產(chǎn)前暴露于PAHs可能促進I型糖尿病的發(fā)病。

作者使用8種PAHs的混合物進行了實驗，以研究產(chǎn)前PAHs對成年期胰島細胞功能和質(zhì)量的影響，同時試圖闡明 I型糖尿病發(fā)病的環(huán)境原因。他們分離了成年雄性小鼠的胰島，對胰島素編碼基因的啟動子DNA甲基化水平進行分析。

研究成果：

▲圖1. 產(chǎn)前暴露于多環(huán)芳烴對成年雄性小鼠胰島素編碼基因甲基化水平的影響。(A) 數(shù)字PCR結(jié)果代表性一維圖。(B)胰島素編碼基因啟動子甲基化水平。(每個處理三只母鼠, 每只母鼠取一個雄性后代) 。

在本研究中，子宮內(nèi)暴露于500μg/kg PAHs的小鼠胰島中胰島素編碼基因啟動子中的DNA甲基化水平顯著增加，同時胰島素編碼基因轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。

▲圖2. 不同PAHs濃度對胰島素編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

期刊介紹：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977創(chuàng)刊，隸屬于愛思唯爾出版集團。是一份多學科交叉期刊，主要研究環(huán)境污染對包括人類健康在內(nèi)的生物體的暴露和影響。最新影響因子為7.129。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。

導讀

除了在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外，tRNA可以被切割成較短的生物活性片段，稱為tRNA片段（tRFs）。來自精細胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代謝紊亂。因此，種系細胞中的tRFs是表觀遺傳的一種機制，然而壓力和毒素會導致tRFs模式的改變。華盛頓大學婦產(chǎn)科臨床研究部的研究人員在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上發(fā)表題為《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究對注射類藥物（一個重要的壓力源）是否會影響生殖細胞中的tRFs感興趣。研究者對來自注射阿pian類藥物病人(PWID)和非藥物使用對照組精液來源外泌體及精母細胞進行了RNA測序。測序后采用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)驗證數(shù)據(jù)，該技術(shù)的應(yīng)用為藥物濫用相關(guān)生育問題的研究提供了新的策略和方法。

阿pian藥物濫用對生殖系統(tǒng)的影響一直備受關(guān)注。近期一項研究揭示了注射阿pian類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體的變化。該研究通過數(shù)字PCR技術(shù)檢測tRNA-Gly-GCC外泌體，發(fā)現(xiàn)未注射阿pian類藥物的男性與注射阿pian類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體存在顯著差異。

tRNA-Gly-GCC外泌體在精子發(fā)生和成熟過程中扮演關(guān)鍵角色。研究結(jié)果表明，這些差異可能與精子質(zhì)量和生育能力的下降有關(guān)。naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)在本研究中的應(yīng)用，不僅提供了高靈敏度和高準確性的檢測方法，對揭示阿pian類藥物對生殖系統(tǒng)的影響具有重要意義。

應(yīng)用亮點：

?  naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)可以在RNA濃度低于檢測下限的樣品中檢測兩種tRFs形式。

? naica^?微滴芯片數(shù)字PCR結(jié)果與RNA測序結(jié)果具有很好的相關(guān)性，但比測序具有更高的靈敏度和準確性，有助于深入了解長期使用阿pian類藥物的生物學影響。

研究結(jié)果：

▲圖１.男性長期使用阿pian類藥物導致精子中tRF-Gly亞型比例的變化,使用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)定量tRFs。成熟精子細胞通過45-90% Percoll梯度純化，并使用核苷素試劑盒分離小RNA。cDNA使用一種特定的莖環(huán)RT引物與“長”tsRNA亞型（53個核苷酸長）或另一種靶向“短”tsRNA變體（32個核苷酸長）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“長”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（C）“長”與“短”tRF Gly-GCC亞型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的濃度?！癈”：對照組（不注射藥品的男性）;“PWID”：阿pian藥物注射組。P值通過單尾曼-惠特尼U檢驗計算。對照組：n=10，PWID組：n=13。

研究發(fā)現(xiàn)，對照組中超過90%的reads到較短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的讀數(shù)。相比之下，對照組中只有4.1%的reads到更長的tRF，而PWID為45.6%。PWID的長/短tRF比顯著高于對照組。同時發(fā)現(xiàn)精液來源的外泌體中小核仁RNA（snoRNA）表達差異。盡管無法確立PWID的發(fā)現(xiàn)與阿pian類藥物使用之間的直接聯(lián)系，但研究表明阿pian類藥物注射和/或相關(guān)多藥使用習慣和生活方式改變可能會影響表觀遺傳。這為阿pian類藥物使用的可遺傳影響提供了證據(jù)，并為進一步研究其跨代健康影響的機制奠定了基礎(chǔ)。

數(shù)字PCR技術(shù)在研究PWID中差異表達的tRFs方面發(fā)揮了重要作用。由于精液中含有復(fù)雜的細胞混合物，意味著其中含有抑制劑，對于PCR的擴增有很大影響。但數(shù)字PCR有抗抑制劑干擾的特點，所以對于這類復(fù)雜樣本的檢測更為適用。文章中數(shù)字PCR和測序各自發(fā)揮了作用：測序用于發(fā)現(xiàn)長tRF和短tRF，而數(shù)字PCR則準確檢測了tRF片段的表達差異，進而驗證了測序的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)表明，數(shù)字PCR在研究tRFs和其他非編碼RNA片段方面具有顯著的優(yōu)勢。數(shù)字PCR不僅可以在tRFs和其他類似的研究中提供更為精確的結(jié)果，還可以在諸如癌癥、遺傳學和傳染病等領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。

naica^?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的juedui拷貝數(shù)濃度。

導讀

據(jù)報道，截至目前兩臺“奶茶“Naica全自動微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)正式在上海交大落戶啦-上海交通大學生物醫(yī)學工程學院和上海交通大學分析測試ZX，感謝上海交大各位老師們的大力支持，順利完成安裝培訓并啟用！

不需要標準品可以對低拷貝基因定量，對微小差異的基因進行分析，對含YZ劑的樣本進行準確定量等，彌補了二代PCR技術(shù)也就是熒光PCR的不足。目前數(shù)字PCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在腫瘤學研究、NIPT研究、液態(tài)活檢、基因編輯、細胞ZL質(zhì)控、用藥及移植監(jiān)控、致病微生物檢測、食品安全、環(huán)境檢測、核酸類標準物質(zhì)定量等方面。

此次“奶茶”Naica系統(tǒng)的順利使用支持其科研團隊在分子與納米醫(yī)學領(lǐng)域，聚焦重大臨床早期診斷和疾病預(yù)后等專項科研成果的轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究，攻克關(guān)鍵技術(shù)難題，推進 “產(chǎn)學研醫(yī)”有機結(jié)合的科技成果產(chǎn)業(yè)化進程。

“奶茶”Naica系統(tǒng)的落戶可為核酸定量、生物醫(yī)學研究、水質(zhì)檢測、食品檢測、轉(zhuǎn)基因成分檢測、環(huán)境污染物分析等多方面檢測提供更可靠的平臺。

非常感謝用戶對我們的平臺的認可，同時也希望”奶茶“Naica全自動微滴芯片數(shù)字PCR為越來越多的用戶檢測提供更便捷，更可靠的技術(shù)。

更多“奶茶“Naica數(shù)字PCR信息可登陸www.cycloudbio.com查看。同時由法國Stilla Technologies公司開發(fā)Gene-π作為數(shù)字PCR學習交流平臺，為您全方位解讀數(shù)字PCR技術(shù)，為用戶提供數(shù)字PCR技術(shù)信息，您也可以選擇感興趣的應(yīng)用教程，其中包含從實驗設(shè)計到數(shù)據(jù)分析的詳細工作流程。您還可以通過搜索導航工具直接搜索特定的項目（"dPCR的DNA準備"，"熒光溢出"等），或點擊我們的"HOW TO" 選擇您需要的部分（設(shè)計、分析、報告）。詳細信息可登陸網(wǎng)站：https://www.gene-pi.com/查看。

導讀

韓牛（Bos taurus coreanae）是一種馴化的哺乳動物，在韓國消費市場作為食物資源，其牛肉消費量遠超其他品種，這種消費模式導致了區(qū)分韓牛和其他牛品種的分子研究的出現(xiàn)。不僅是牛，其他經(jīng)濟動物的不同品種在市場中的經(jīng)濟價值也存在較大的差異，所以準確進行種質(zhì)鑒定勢在必行。

在之前的一項研究中，使用傳統(tǒng)的PCR方法和Sanger測序驗證確定了由TE關(guān)聯(lián)缺失事件產(chǎn)生的韓牛特異性SV。它可以用作區(qū)分不同牛品種的分子標記（即韓牛與荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每個樣品都有各種最終拷貝定量。為了克服傳統(tǒng)PCR的局限性，并準確評估先前研究中確定的韓牛特異性SV位點，檀國大學生物醫(yī)學科學系聯(lián)合畜牧研究所和檀國大學醫(yī)學院，使用naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對韓牛特異性SV位點進行了更為精確的檢測，并將成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》發(fā)表在Genomics & Informatics雜志上。

轉(zhuǎn)座元件（TEs）約占牛基因組的一半。它們可以是一個強大的物種特異性標記，在基因組進化時沒有結(jié)構(gòu)變異（SV）的回歸突變。因此，作者應(yīng)用naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對韓牛特異性SV進行準確的定量檢測。雖然樣品在韓牛群體中的等位基因頻率變化較低，但naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以通過絕對定量進行高靈敏度檢測，可以做到比PCR更準確的定量。所以naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)平臺相比于傳統(tǒng)PCR更適用于分子標志物的定量評價。

應(yīng)用亮點：

?  使用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對韓牛特異性SV進行準確的定量檢測。

? dPCR測定在計數(shù)單分子和分析特定群體的少量拷貝時可以高精度地定量，與qPCR相比，具有更高的準確性。

? 經(jīng)過sanger測序，確定了naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測準確無誤，且操作和成本均低于測序。

? naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)適用于分子標志物的定量評價。

實驗方法：

檢測樣本信息：

共提取了五個棕色韓牛DNA和五個荷斯坦DNA作為實驗樣本。

檢測方法：

為了更準確地檢測韓牛特異性SV，將“Del_96”位點應(yīng)用于naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)（Stilla Technologies）。進行naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)前確認韓牛和荷斯坦牛的DNA的濃度定量。FAM引物組和FAM探針用于檢測韓牛和荷斯坦?；蚪M。VIC引物組和VIC探針設(shè)計在韓牛特異性缺失（圖 1B)。因此，F(xiàn)AM引物組和FAM探針（陽性對照）設(shè)計在所有牛DNA中檢測。VIC引物組和VIC探針設(shè)計用于僅檢測韓牛的熒光。

▲圖 1B

實驗結(jié)果：

FAM染料在所有?；蚪M中均被檢測到，VIC染料僅在韓牛樣品中顯示出顯著的檢測。這表明所有韓牛基因組都包含特定的缺失序列（Del_96區(qū)域）。在韓牛樣品中檢測到VIC染料的信號平均濃度為243（copies/ μL）。雖然在荷斯坦樣品中也檢測到平均濃度0.12（copies/μL）的VIC染料信號，但這些信號相比韓?？珊雎圆挥?。

▲naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測韓Del_96和荷斯坦樣品之間區(qū)域的絕對拷貝數(shù)比較。濃度圖在 X 軸上指示樣品數(shù)，在 Y 軸上指示對數(shù)刻度條（拷貝/μL）。（A）在所有樣品中檢測到FAM熒光。韓牛樣品的絕對拷貝數(shù)大約是荷斯坦樣品的兩倍。（B）僅在韓牛樣品中強烈檢測到VIC熒光。

最后，文章Results and Discussion給出-數(shù)字PCR適合作為驗證物種特異性標記的平臺。

綜上，對于naica??微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，準確定量絕對拷貝數(shù)是一個關(guān)鍵特征，相比qPCR準確性更高，naica?微滴芯片數(shù)字PCR為本文的檢測提供了有利的支持，也驗證了這一特征。在不久的將來，通過將物種識別工具應(yīng)用于naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，它作為大樣本量物種鑒定平臺具有巨大潛力。所以naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)適合作為驗證物種特異性標記的平臺。

期刊介紹：

Genomics & Informatics是由韓國基因組組織發(fā)行的涉及農(nóng)業(yè)和生物科學、生物化學、遺傳學、分子生物學、健康信息學等領(lǐng)域的期刊。

法國Stilla Technologies公司開發(fā)的—款多重PCR專用預(yù)混液：naica^?multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測。并對naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測性能進行了詳細評估。當面對有限的樣本量時，可保證多重數(shù)字PCR檢測的靈敏度和準確性；在復(fù)雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進行6個靶標的同步準確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進行6個靶標的線性范圍分析，結(jié)果顯示6個靶標的R²均＞0.99，說明在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實現(xiàn)6靶標同步準確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進行6個靶標的線性分析，分別在藍色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個通道進行檢測。每個稀釋點的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個稀釋度進行3次重復(fù)。結(jié)果顯示6個靶標的R2均大于0.99，說明所有靶標的結(jié)果都高度真實可靠。

★ 在復(fù)雜的背景基因下，對低豐度目的基因進行精確定量

數(shù)字PCR的—個重要技術(shù)優(yōu)勢是能夠在存在多個靶標擴增的情況下檢測到低濃度靶標。為了評估naica^?multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個目標DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進行檢測，同時其中摻入5種外部靶標模板（每個靶標的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A和2C)。這些結(jié)果與同一DNA 靶點在不同濃度下單獨檢測以及在不添加外部靶標的情況下獲得的結(jié)果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴增結(jié)果真實可靠。將pUC18質(zhì)粒（圖A和B)和pUC57質(zhì)粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個外部擴增靶標背景下（每個靶標為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(B,D)的情況下進行定量檢測，3次重復(fù)。線性擬合系數(shù) R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標的測定結(jié)果都是真實可靠的。5個外部靶標的相對標準偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復(fù)性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應(yīng)用亮點

?  實現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測的高度穩(wěn)定性和高檢測靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動態(tài)范圍內(nèi)同時定量檢測6個獨立的DNA靶標，均具有良好線性關(guān)系；

?  5X和10X的數(shù)字PCR預(yù)混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號及規(guī)格

naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的拷貝數(shù)濃度。

數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。

微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)，是一種對核酸分子進行絕對定量的方法。

DDPCR的原理是在PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

在ddPCR中的微液滴產(chǎn)生中，ddPCR-DG7500油相可以直接和PCR擴增試劑（包含待測的DNA樣品）注入到液滴合成芯片中，產(chǎn)生所需要尺寸的乳液滴微球。隨后，將獲得的乳液滴微球進行PCR擴增。

ddPCR-DG7500油相是一種包含PFPE-PEG混合結(jié)構(gòu)的HFE7500油相溶液，可以直接用于ddPCR中的乳液微球產(chǎn)生，無需再進行二次處理。該油相可以幫助用戶節(jié)省實驗時間，獲得良好的實驗結(jié)果，同時把精力用于目標產(chǎn)物上，不用擔心因油相質(zhì)量不穩(wěn)定而產(chǎn)生的不良目標產(chǎn)物。

ddPCR-DG7500油相試劑是一種液體狀態(tài)，提供1mL包裝和2mL包裝的兩種規(guī)格。

名稱：數(shù)字PCR油相7500試劑

型號：ddPCR-DG7500

規(guī)格：液體狀態(tài)，4℃環(huán)境保存，體積：1mL，EP管包裝，即開即用。