導(dǎo)讀

反芻動物是指具有反芻習(xí)性的一類哺乳動物，如牛、羊、長頸鹿、兔子等。反芻動物采食一般比較匆忙，大部分未經(jīng)充分咀嚼就吞咽進(jìn)入瘤胃，經(jīng)過瘤胃浸泡和軟化一段時(shí)間后，食物經(jīng)逆嘔重新回到口腔，經(jīng)過再咀嚼混入唾液并再吞咽進(jìn)入瘤胃，這種行為稱為反芻行為。反芻動物的食物種類比其他種類的動物更豐富，結(jié)構(gòu)組成也更復(fù)雜，但草料中的粗纖維含量較高導(dǎo)致其難以消化，反芻動物依賴于胃部微生物群的代謝能力來消化各種物質(zhì)，但其轉(zhuǎn)化效率低也是養(yǎng)殖業(yè)廣泛關(guān)注的問題。

雖然已有研究證明瘤胃中不同微生物的活性可以調(diào)節(jié)宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物卻很少受到關(guān)注。奧地利維也納獸醫(yī)大學(xué)的Cameron等人在Research Square在線發(fā)表了題為《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究論文。文章采用多重?cái)?shù)字PCR（dPCR）量化同一菌科的兩種菌群，分析反芻動物瘤胃上的定植菌群分布及生物進(jìn)化動態(tài)，為今后畜牧業(yè)提高動物代謝能力的研究提供了新思路。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  宏基因組測序發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮細(xì)胞中彎曲桿菌科兩個(gè)種群的基因序列高度相似，利用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以對兩個(gè)種群進(jìn)行精準(zhǔn)量化。

? 使用不同培養(yǎng)添加物后，可以利用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行微生物種群分布跟蹤。

研究成果：

作者通過對瘤胃上皮微生物組的16S rRNA擴(kuò)增子分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)優(yōu)勢菌株（OTU）為彎曲桿菌科（Campylobacteraceae），并通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)該OTU兩個(gè)主要種群Ca. C. stinkeris與Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白質(zhì)糖基化）操縱子不同。

為了探究Ca. C. stinkeris與Ca. C. noahi兩個(gè)種群空間分布的差異，作者通過naica^?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)比較了這兩個(gè)種群在不同動物瘤胃乳突離上皮壁最近和最遠(yuǎn)兩個(gè)位置的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同動物的兩個(gè)種群在這兩個(gè)位置的比例接近。

▲圖1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在動物瘤胃乳突頂端和隱窩的含量比例。A）從乳突切片兩個(gè)位置提取DNA使用dPCR進(jìn)行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在動物瘤胃乳突兩個(gè)位置的含量比例。橫坐標(biāo)為取樣動物的名字。

然后作者使用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對兩種菌群進(jìn)行生長和適應(yīng)性測定，數(shù)據(jù)顯示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸鹽為主要碳源時(shí)積累的生物量，更好地生長，但被丙酸鹽抑制，而Ca. C. noahiz在任何一種添加物存在的情況下在都沒有檢測到生長優(yōu)勢。因此，作者推斷可能存在一些其他機(jī)制來最小化競爭，這種機(jī)制通過某些代謝生態(tài)位維度上的分化，防止它們生長動力學(xué)的重疊來支持兩個(gè)種群的共存。

▲圖2 醋酸鹽利用和丙酸鹽抗性檢測。A)通過種群特異性dPCR，評估添加5 mM醋酸鹽（acetate）或丙酸鹽（propionate）對生物量積累的影響。分別用單個(gè)菌株(左，單一培養(yǎng))和競爭菌株(右，共培養(yǎng))進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

通過數(shù)字PCR這種定量技術(shù)，作者發(fā)現(xiàn)在瘤胃乳突的頂端和隱窩都分布有這兩種優(yōu)勢菌群，且與上皮細(xì)胞分布數(shù)目無顯著的相關(guān)性。另外，這兩種菌群能夠促進(jìn)相關(guān)脂肪酸的代謝，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)食物消化的功能。該文章為通過調(diào)節(jié)反芻動物體內(nèi)某些鹽離子濃度來調(diào)節(jié)優(yōu)勢菌群的分布比例進(jìn)而提升消化能力提供了思路。

導(dǎo)讀

在過去的幾十年中，糖尿病的發(fā)病率在顯著增長。除了不健康的生活方式外，環(huán)境污染物被認(rèn)為是糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。多環(huán)芳烴 (PAH)是一類含有2-7個(gè)芳環(huán)的有機(jī)化合物，由自然和人類活動產(chǎn)生并廣泛存在的污染物。流行病學(xué)研究表明，PAHs水平與成人和兒童的肥胖和二型糖尿病相關(guān)。

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在Ecotoxicology and Environmental Safety上發(fā)表了題為《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中應(yīng)用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對胰島素編碼基因DNA甲基化水平進(jìn)行量化，揭示了產(chǎn)前暴露于多環(huán)芳烴混合物對成年雄性小鼠胰島細(xì)胞功能的不良影響。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  使用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對胰島素編碼基因啟動子甲基化水平進(jìn)行量化。

? 在產(chǎn)前暴露于500μg/kg PAHs的小鼠中，胰島素編碼基因啟動子的甲基化水平顯著升高。

? 產(chǎn)前暴露于PAHs可能促進(jìn)I型糖尿病的發(fā)病。

作者使用8種PAHs的混合物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，以研究產(chǎn)前PAHs對成年期胰島細(xì)胞功能和質(zhì)量的影響，同時(shí)試圖闡明 I型糖尿病發(fā)病的環(huán)境原因。他們分離了成年雄性小鼠的胰島，對胰島素編碼基因的啟動子DNA甲基化水平進(jìn)行分析。

研究成果：

▲圖1. 產(chǎn)前暴露于多環(huán)芳烴對成年雄性小鼠胰島素編碼基因甲基化水平的影響。(A) 數(shù)字PCR結(jié)果代表性一維圖。(B)胰島素編碼基因啟動子甲基化水平。(每個(gè)處理三只母鼠, 每只母鼠取一個(gè)雄性后代) 。

在本研究中，子宮內(nèi)暴露于500μg/kg PAHs的小鼠胰島中胰島素編碼基因啟動子中的DNA甲基化水平顯著增加，同時(shí)胰島素編碼基因轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。

▲圖2. 不同PAHs濃度對胰島素編碼基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

期刊介紹：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977創(chuàng)刊，隸屬于愛思唯爾出版集團(tuán)。是一份多學(xué)科交叉期刊，主要研究環(huán)境污染對包括人類健康在內(nèi)的生物體的暴露和影響。最新影響因子為7.129。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)濃度。

導(dǎo)讀

韓牛（Bos taurus coreanae）是一種馴化的哺乳動物，在韓國消費(fèi)市場作為食物資源，其牛肉消費(fèi)量遠(yuǎn)超其他品種，這種消費(fèi)模式導(dǎo)致了區(qū)分韓牛和其他牛品種的分子研究的出現(xiàn)。不僅是牛，其他經(jīng)濟(jì)動物的不同品種在市場中的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也存在較大的差異，所以準(zhǔn)確進(jìn)行種質(zhì)鑒定勢在必行。

在之前的一項(xiàng)研究中，使用傳統(tǒng)的PCR方法和Sanger測序驗(yàn)證確定了由TE關(guān)聯(lián)缺失事件產(chǎn)生的韓牛特異性SV。它可以用作區(qū)分不同牛品種的分子標(biāo)記（即韓牛與荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每個(gè)樣品都有各種最終拷貝定量。為了克服傳統(tǒng)PCR的局限性，并準(zhǔn)確評估先前研究中確定的韓牛特異性SV位點(diǎn)，檀國大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系聯(lián)合畜牧研究所和檀國大學(xué)醫(yī)學(xué)院，使用naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對韓牛特異性SV位點(diǎn)進(jìn)行了更為精確的檢測，并將成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》發(fā)表在Genomics & Informatics雜志上。

轉(zhuǎn)座元件（TEs）約占?；蚪M的一半。它們可以是一個(gè)強(qiáng)大的物種特異性標(biāo)記，在基因組進(jìn)化時(shí)沒有結(jié)構(gòu)變異（SV）的回歸突變。因此，作者應(yīng)用naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對韓牛特異性SV進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。雖然樣品在韓牛群體中的等位基因頻率變化較低，但naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以通過絕對定量進(jìn)行高靈敏度檢測，可以做到比PCR更準(zhǔn)確的定量。所以naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)平臺相比于傳統(tǒng)PCR更適用于分子標(biāo)志物的定量評價(jià)。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  使用naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對韓牛特異性SV進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。

? dPCR測定在計(jì)數(shù)單分子和分析特定群體的少量拷貝時(shí)可以高精度地定量，與qPCR相比，具有更高的準(zhǔn)確性。

? 經(jīng)過sanger測序，確定了naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測準(zhǔn)確無誤，且操作和成本均低于測序。

? naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)適用于分子標(biāo)志物的定量評價(jià)。

實(shí)驗(yàn)方法：

檢測樣本信息：

共提取了五個(gè)棕色韓牛DNA和五個(gè)荷斯坦DNA作為實(shí)驗(yàn)樣本。

檢測方法：

為了更準(zhǔn)確地檢測韓牛特異性SV，將“Del_96”位點(diǎn)應(yīng)用于naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)（Stilla Technologies）。進(jìn)行naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)前確認(rèn)韓牛和荷斯坦牛的DNA的濃度定量。FAM引物組和FAM探針用于檢測韓牛和荷斯坦?；蚪M。VIC引物組和VIC探針設(shè)計(jì)在韓牛特異性缺失（圖 1B)。因此，F(xiàn)AM引物組和FAM探針（陽性對照）設(shè)計(jì)在所有牛DNA中檢測。VIC引物組和VIC探針設(shè)計(jì)用于僅檢測韓牛的熒光。

▲圖 1B

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FAM染料在所有?；蚪M中均被檢測到，VIC染料僅在韓牛樣品中顯示出顯著的檢測。這表明所有韓?；蚪M都包含特定的缺失序列（Del_96區(qū)域）。在韓牛樣品中檢測到VIC染料的信號平均濃度為243（copies/ μL）。雖然在荷斯坦樣品中也檢測到平均濃度0.12（copies/μL）的VIC染料信號，但這些信號相比韓?？珊雎圆挥?jì)。

▲naica?微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測韓Del_96和荷斯坦樣品之間區(qū)域的絕對拷貝數(shù)比較。濃度圖在 X 軸上指示樣品數(shù)，在 Y 軸上指示對數(shù)刻度條（拷貝/μL）。（A）在所有樣品中檢測到FAM熒光。韓牛樣品的絕對拷貝數(shù)大約是荷斯坦樣品的兩倍。（B）僅在韓牛樣品中強(qiáng)烈檢測到VIC熒光。

最后，文章Results and Discussion給出-數(shù)字PCR適合作為驗(yàn)證物種特異性標(biāo)記的平臺。

綜上，對于naica??微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，準(zhǔn)確定量絕對拷貝數(shù)是一個(gè)關(guān)鍵特征，相比qPCR準(zhǔn)確性更高，naica?微滴芯片數(shù)字PCR為本文的檢測提供了有利的支持，也驗(yàn)證了這一特征。在不久的將來，通過將物種識別工具應(yīng)用于naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，它作為大樣本量物種鑒定平臺具有巨大潛力。所以naica??微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)適合作為驗(yàn)證物種特異性標(biāo)記的平臺。

期刊介紹：

Genomics & Informatics是由韓國基因組組織發(fā)行的涉及農(nóng)業(yè)和生物科學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、健康信息學(xué)等領(lǐng)域的期刊。

導(dǎo)讀

盡管各國衛(wèi)生系統(tǒng)發(fā)展迅速，但由病原菌引起的傳染病仍然是人類健康的主要威脅之一。據(jù)報(bào)道，全世界每年有220多萬人死于水傳播大腸桿菌病原體。盡管大多數(shù)大腸菌群是無害的，但某些大腸桿菌的存在可能會導(dǎo)致甚至威脅到人類健康，例如，大腸桿菌O157:H7和其他產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常見因素，可能對健康造成嚴(yán)重后果，尤其是對幼兒。因此，檢測大腸桿菌對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及食品、水和空氣質(zhì)量監(jiān)測非常重要。

大連理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，工業(yè)生態(tài)學(xué)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家，開發(fā)出基于naica?全自動微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單細(xì)菌檢測方法，該方法可以在1.5小時(shí)內(nèi)以單細(xì)胞靈敏度選擇性檢測臨床尿液樣本中的大腸桿菌 。該方法發(fā)表在《Analytical Methods》，題為“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  dDRCA系統(tǒng)，能夠快速、選擇性地檢測具有單細(xì)胞敏感性的大腸桿菌 ，dDRCA系統(tǒng)的檢測靈敏度比之前報(bào)道的PAD高1000倍。

? 證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染診斷中的潛在臨床適用性，dDRCA能夠在不到1.5小時(shí)內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時(shí)。

文中采用naica??全自動微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)液滴微流控技術(shù)，快速精準(zhǔn)的檢測到復(fù)雜樣本和高背景樣本中的致病大腸桿菌。

通常擴(kuò)增需要約4小時(shí)進(jìn)行定量大腸桿菌檢測。在這項(xiàng)研究中，我們描述了DNA酶偶聯(lián)滾圈擴(kuò)增（RCA），這是一種高效的等溫酶DNA復(fù)制過程，可在naica??全自動微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，以建立液滴DNA酶偶聯(lián)RCA（表示為dDRCA）系統(tǒng)。我們進(jìn)一步證明，該系統(tǒng)能夠在1.5小時(shí)內(nèi)以單細(xì)胞敏感性選擇性檢測臨床尿液樣本中的大腸桿菌。

▲圖2（a）通過瓊脂糖凝膠電泳分析RCA產(chǎn)物（RP）。（b） 反應(yīng)混合物在指示反應(yīng)條件下的熒光響應(yīng)：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line);  RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line);  RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line); + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3閱讀器圖像（左）、CLSM圖像（中）和熒光顯微鏡圖像（右）為微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反應(yīng)條件下dDRCA系統(tǒng)的熒光圖像和熒光滴數(shù)：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli;（e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli; (f) -RFD-EC1/+ RDS/  E. coli; (g) + RFD-EC1/+ RDS/  E. coli.

使用Naica Prism3閱讀器對生成的熒光液滴進(jìn)行成像和分析。dDRCA系統(tǒng)能夠在75分鐘內(nèi)選擇性計(jì)數(shù)具有單細(xì)胞敏感性的大腸桿菌，包括20分鐘的細(xì)胞裂解時(shí)間、12分鐘的液滴生成時(shí)間和43分鐘的液滴反應(yīng)時(shí)間。

通過比較其他三種常見細(xì)菌，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli）存在時(shí)的信號反應(yīng)，也檢查了dDRCA檢測大腸桿菌的選擇性。當(dāng)用緩沖液或尿液中的這些意外靶點(diǎn)測試每個(gè)dDRCA系統(tǒng)時(shí)，未觀察到明顯的熒光液滴（圖4c和S4?）。

▲圖4（a）不同大腸桿菌濃度（每毫升細(xì)胞數(shù)）下dDRCA反應(yīng)的熒光圖像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同濃度下計(jì)數(shù)的液滴數(shù)與大腸桿菌之間的關(guān)系。提供了計(jì)數(shù)的液滴數(shù)量，插圖顯示了1–104大腸桿菌范圍內(nèi)的線性反應(yīng)。誤差條代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。（c） dDRCA的特異性。

最終證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染（UTI）診斷中的潛在臨床適用性。分析了20份患者和健康獻(xiàn)血者的臨床尿樣。整個(gè)操作程序包括：（1）細(xì)胞收集和裂解（25分鐘）；（2） 液滴生成（12分鐘）；（3） 液滴反應(yīng)（43分鐘）。如圖5c所示，五個(gè)尿樣，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿樣產(chǎn)生大量熒光液滴（>3000）。使用傳統(tǒng)的大腸桿菌培養(yǎng)方法進(jìn)一步確認(rèn)了這些有無大腸桿菌感染的樣本（圖5d）。因此，對UTI的診斷有很大的希望。

▲圖5（a）檢測尿液樣本中的大腸桿菌。（b） 顯示尿液樣本中計(jì)數(shù)數(shù)與大腸桿菌細(xì)胞在1-104范圍內(nèi)的線性相關(guān)性的曲線圖。（c） 20份臨床尿液樣本中陽性液滴的數(shù)量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖電解質(zhì)缺乏）瓊脂細(xì)菌尿液培養(yǎng)板。黃色菌落代表大腸桿菌在37℃的CLED瓊脂中培養(yǎng)22小時(shí)后的生長。

該系統(tǒng)能夠在不到1.5小時(shí)的分析時(shí)間內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時(shí)。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)濃度。

導(dǎo)讀

除了在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外，tRNA可以被切割成較短的生物活性片段，稱為tRNA片段（tRFs）。來自精細(xì)胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代謝紊亂。因此，種系細(xì)胞中的tRFs是表觀遺傳的一種機(jī)制，然而壓力和毒素會導(dǎo)致tRFs模式的改變。華盛頓大學(xué)婦產(chǎn)科臨床研究部的研究人員在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上發(fā)表題為《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究對注射類藥物（一個(gè)重要的壓力源）是否會影響生殖細(xì)胞中的tRFs感興趣。研究者對來自注射阿pian類藥物病人(PWID)和非藥物使用對照組精液來源外泌體及精母細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。測序后采用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，該技術(shù)的應(yīng)用為藥物濫用相關(guān)生育問題的研究提供了新的策略和方法。

阿pian藥物濫用對生殖系統(tǒng)的影響一直備受關(guān)注。近期一項(xiàng)研究揭示了注射阿pian類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體的變化。該研究通過數(shù)字PCR技術(shù)檢測tRNA-Gly-GCC外泌體，發(fā)現(xiàn)未注射阿pian類藥物的男性與注射阿pian類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體存在顯著差異。

tRNA-Gly-GCC外泌體在精子發(fā)生和成熟過程中扮演關(guān)鍵角色。研究結(jié)果表明，這些差異可能與精子質(zhì)量和生育能力的下降有關(guān)。naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)在本研究中的應(yīng)用，不僅提供了高靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測方法，對揭示阿pian類藥物對生殖系統(tǒng)的影響具有重要意義。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)可以在RNA濃度低于檢測下限的樣品中檢測兩種tRFs形式。

? naica^?微滴芯片數(shù)字PCR結(jié)果與RNA測序結(jié)果具有很好的相關(guān)性，但比測序具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，有助于深入了解長期使用阿pian類藥物的生物學(xué)影響。

研究結(jié)果：

▲圖１.男性長期使用阿pian類藥物導(dǎo)致精子中tRF-Gly亞型比例的變化,使用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)定量tRFs。成熟精子細(xì)胞通過45-90% Percoll梯度純化，并使用核苷素試劑盒分離小RNA。cDNA使用一種特定的莖環(huán)RT引物與“長”tsRNA亞型（53個(gè)核苷酸長）或另一種靶向“短”tsRNA變體（32個(gè)核苷酸長）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“長”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（C）“長”與“短”tRF Gly-GCC亞型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的濃度?！癈”：對照組（不注射藥品的男性）;“PWID”：阿pian藥物注射組。P值通過單尾曼-惠特尼U檢驗(yàn)計(jì)算。對照組：n=10，PWID組：n=13。

研究發(fā)現(xiàn)，對照組中超過90%的reads到較短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的讀數(shù)。相比之下，對照組中只有4.1%的reads到更長的tRF，而PWID為45.6%。PWID的長/短tRF比顯著高于對照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)精液來源的外泌體中小核仁RNA（snoRNA）表達(dá)差異。盡管無法確立PWID的發(fā)現(xiàn)與阿pian類藥物使用之間的直接聯(lián)系，但研究表明阿pian類藥物注射和/或相關(guān)多藥使用習(xí)慣和生活方式改變可能會影響表觀遺傳。這為阿pian類藥物使用的可遺傳影響提供了證據(jù)，并為進(jìn)一步研究其跨代健康影響的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

數(shù)字PCR技術(shù)在研究PWID中差異表達(dá)的tRFs方面發(fā)揮了重要作用。由于精液中含有復(fù)雜的細(xì)胞混合物，意味著其中含有抑制劑，對于PCR的擴(kuò)增有很大影響。但數(shù)字PCR有抗抑制劑干擾的特點(diǎn)，所以對于這類復(fù)雜樣本的檢測更為適用。文章中數(shù)字PCR和測序各自發(fā)揮了作用：測序用于發(fā)現(xiàn)長tRF和短tRF，而數(shù)字PCR則準(zhǔn)確檢測了tRF片段的表達(dá)差異，進(jìn)而驗(yàn)證了測序的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)表明，數(shù)字PCR在研究tRFs和其他非編碼RNA片段方面具有顯著的優(yōu)勢。數(shù)字PCR不僅可以在tRFs和其他類似的研究中提供更為精確的結(jié)果，還可以在諸如癌癥、遺傳學(xué)和傳染病等領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。

naica^?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的juedui拷貝數(shù)濃度。

導(dǎo)讀

據(jù)報(bào)道，截至目前兩臺“奶茶“Naica全自動微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)正式在上海交大落戶啦-上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院和上海交通大學(xué)分析測試ZX，感謝上海交大各位老師們的大力支持，順利完成安裝培訓(xùn)并啟用！

不需要標(biāo)準(zhǔn)品可以對低拷貝基因定量，對微小差異的基因進(jìn)行分析，對含YZ劑的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量等，彌補(bǔ)了二代PCR技術(shù)也就是熒光PCR的不足。目前數(shù)字PCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在腫瘤學(xué)研究、NIPT研究、液態(tài)活檢、基因編輯、細(xì)胞ZL質(zhì)控、用藥及移植監(jiān)控、致病微生物檢測、食品安全、環(huán)境檢測、核酸類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量等方面。

此次“奶茶”Naica系統(tǒng)的順利使用支持其科研團(tuán)隊(duì)在分子與納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，聚焦重大臨床早期診斷和疾病預(yù)后等專項(xiàng)科研成果的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，攻克關(guān)鍵技術(shù)難題，推進(jìn) “產(chǎn)學(xué)研醫(yī)”有機(jī)結(jié)合的科技成果產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

“奶茶”Naica系統(tǒng)的落戶可為核酸定量、生物醫(yī)學(xué)研究、水質(zhì)檢測、食品檢測、轉(zhuǎn)基因成分檢測、環(huán)境污染物分析等多方面檢測提供更可靠的平臺。

非常感謝用戶對我們的平臺的認(rèn)可，同時(shí)也希望”奶茶“Naica全自動微滴芯片數(shù)字PCR為越來越多的用戶檢測提供更便捷，更可靠的技術(shù)。

更多“奶茶“Naica數(shù)字PCR信息可登陸www.cycloudbio.com查看。同時(shí)由法國Stilla Technologies公司開發(fā)Gene-π作為數(shù)字PCR學(xué)習(xí)交流平臺，為您全方位解讀數(shù)字PCR技術(shù)，為用戶提供數(shù)字PCR技術(shù)信息，您也可以選擇感興趣的應(yīng)用教程，其中包含從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到數(shù)據(jù)分析的詳細(xì)工作流程。您還可以通過搜索導(dǎo)航工具直接搜索特定的項(xiàng)目（"dPCR的DNA準(zhǔn)備"，"熒光溢出"等），或點(diǎn)擊我們的"HOW TO" 選擇您需要的部分（設(shè)計(jì)、分析、報(bào)告）。詳細(xì)信息可登陸網(wǎng)站：https://www.gene-pi.com/查看。

背景導(dǎo)讀—何為嵌合狀態(tài)的檢測？

gusui和外周血干細(xì)胞移植是許多惡性和非惡性疾病的有效ZL方法。造血干細(xì)胞移植后，受體產(chǎn)生新的血細(xì)胞，這些血細(xì)胞在遺傳上來自于供體DNA。確認(rèn)新的造血系統(tǒng)來源于供體是臨床復(fù)發(fā)監(jiān)測的重要組成部分。一般采用血細(xì)胞基因型檢測的方式，稱為嵌合體分析。完全供體細(xì)胞嵌合狀態(tài)意味著100%的血細(xì)胞來自供體，而混合或部分嵌合意味著受體細(xì)胞也存在。因此檢測時(shí)需要分析受體在移植后的血液或gusui中供體和受體的基因型的各自比例。

法國蘇黎世輸血服務(wù)ZX實(shí)驗(yàn)室使用Stilla Technologies的Naica? Crystal數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行雙等位基因單核苷酸變異（SNV）檢測，從而確定嵌合體狀態(tài)。

嵌合體檢測的兩步策略

移植前：要想得到正確的移植后的檢測結(jié)果,必須選擇合適的標(biāo)記物，蘇黎世輸血服務(wù)ZX實(shí)驗(yàn)室建立了一個(gè)由24種特定SNV分析組成的組合，用于尋找在單個(gè)樣品分析中篩選供體和受體DNA的合適標(biāo)記。

移植后：在臨床上，嵌合體監(jiān)測至少需要0.5%的等位基因敏感性。Naica? Crystal 數(shù)字PCR僅使用5ng DNA，就達(dá)到了所需的0.5%的靈敏度。使用標(biāo)準(zhǔn)的20ng DNA進(jìn)行檢測可以使一個(gè)等位基因頻率的可重復(fù)量化精度達(dá)到0.25%。(圖2)

總結(jié)

Naica? Crystal數(shù)字PCR在造血干細(xì)胞移植后嵌合狀態(tài)檢測方面的優(yōu)勢：

?  可與建立的SNV嵌合體檢測方法完全兼容。

?  使用Naica?系統(tǒng)進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)測試可使等位基因頻率檢測靈敏度降至0.25%，遠(yuǎn)低于0.5%的臨床限值要求。

?  此次研究，使用了Naica?系統(tǒng)中的高通量Opal芯片，一次可檢測48個(gè)樣本，每個(gè)樣本可進(jìn)行3熒光通道讀取，僅需較低的DNA輸入量，即可實(shí)現(xiàn)更高的樣品通量和譜系特異性嵌合體檢測的能力。

法國Stilla Technologies公司開發(fā)的—款多重PCR專用預(yù)混液：naica^?multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測。并對naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測性能進(jìn)行了詳細(xì)評估。當(dāng)面對有限的樣本量時(shí)，可保證多重?cái)?shù)字PCR檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性；在復(fù)雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的同步準(zhǔn)確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性范圍分析，結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R²均＞0.99，說明在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實(shí)現(xiàn)6靶標(biāo)同步準(zhǔn)確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進(jìn)行6個(gè)靶標(biāo)的線性分析，分別在藍(lán)色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個(gè)通道進(jìn)行檢測。每個(gè)稀釋點(diǎn)的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果顯示6個(gè)靶標(biāo)的R2均大于0.99，說明所有靶標(biāo)的結(jié)果都高度真實(shí)可靠。

★ 在復(fù)雜的背景基因下，對低豐度目的基因進(jìn)行精確定量

數(shù)字PCR的—個(gè)重要技術(shù)優(yōu)勢是能夠在存在多個(gè)靶標(biāo)擴(kuò)增的情況下檢測到低濃度靶標(biāo)。為了評估naica^?multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個(gè)目標(biāo)DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進(jìn)行檢測，同時(shí)其中摻入5種外部靶標(biāo)模板（每個(gè)靶標(biāo)的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A和2C)。這些結(jié)果與同一DNA 靶點(diǎn)在不同濃度下單獨(dú)檢測以及在不添加外部靶標(biāo)的情況下獲得的結(jié)果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可靠。將pUC18質(zhì)粒（圖A和B)和pUC57質(zhì)粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個(gè)外部擴(kuò)增靶標(biāo)背景下（每個(gè)靶標(biāo)為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(biāo)(B,D)的情況下進(jìn)行定量檢測，3次重復(fù)。線性擬合系數(shù) R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標(biāo)的測定結(jié)果都是真實(shí)可靠的。5個(gè)外部靶標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復(fù)性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應(yīng)用亮點(diǎn)

?  實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測的高度穩(wěn)定性和高檢測靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動態(tài)范圍內(nèi)同時(shí)定量檢測6個(gè)獨(dú)立的DNA靶標(biāo)，均具有良好線性關(guān)系；

?  5X和10X的數(shù)字PCR預(yù)混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標(biāo)時(shí)，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號及規(guī)格

naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度。

數(shù)字PCR可以直接計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷有/無兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。

微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，是一種對核酸分子進(jìn)行絕對定量的方法。

DDPCR的原理是在PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對每個(gè)微滴進(jìn)行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

在ddPCR中的微液滴產(chǎn)生中，ddPCR-DG7500油相可以直接和PCR擴(kuò)增試劑（包含待測的DNA樣品）注入到液滴合成芯片中，產(chǎn)生所需要尺寸的乳液滴微球。隨后，將獲得的乳液滴微球進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

ddPCR-DG7500油相是一種包含PFPE-PEG混合結(jié)構(gòu)的HFE7500油相溶液，可以直接用于ddPCR中的乳液微球產(chǎn)生，無需再進(jìn)行二次處理。該油相可以幫助用戶節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)把精力用于目標(biāo)產(chǎn)物上，不用擔(dān)心因油相質(zhì)量不穩(wěn)定而產(chǎn)生的不良目標(biāo)產(chǎn)物。

ddPCR-DG7500油相試劑是一種液體狀態(tài)，提供1mL包裝和2mL包裝的兩種規(guī)格。

名稱：數(shù)字PCR油相7500試劑

型號：ddPCR-DG7500

規(guī)格：液體狀態(tài)，4℃環(huán)境保存，體積：1mL，EP管包裝，即開即用。