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  姐姐是魔鬼 2015-10-17 00:00:00

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  走巴走巴 2015-10-19 00:00:00

  如何制作氣凝膠 氣凝膠又稱凍膠。溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的液體（在干凝膠中也可以是氣體），這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒有流動性。內(nèi)部常含有大量液體。例如血凝膠、瓊脂的含水量都可達99%以上?？煞譃閺椥阅z和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，而當重新吸收分散介質(zhì)時，體積又重新膨脹，例如明膠等。脆性凝膠失去或重新吸收分散介質(zhì)時，形狀和體積都不改變，例如硅膠等。由溶液或溶膠形成凝膠的過程稱為膠凝作用（gelation）。 [編輯本段]生物學(xué)和凝膠 　　生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過實驗選擇出Z有效的純化流程。 　　1.測定——分子量、PI 　　當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y定。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，并選擇純化用緩沖液的Z佳PH. 　　2.選擇——層析方法 　　若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法： 　　一] 使用Z通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。 　　二] 用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。 　　三] 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。 　　3.純化——大量粗品 　　處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE介質(zhì)，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。 　　4.純化——硫酸氨樣品硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇Z適合介質(zhì)及Z佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。 　　5.純水——糖類分子 　　固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個細胞或大復(fù)合物，如膜囊等。 　　6.純化——膜蛋白 　　膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。 　　7.純化——單抗、抗原 *單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對IgG的Fc區(qū)有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG.血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG.重組蛋白A介質(zhì) Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性，基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。 　　*疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。 　　*純化IgG抗原Z有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG，再進一步獲取IgG抗原。 　　*HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結(jié)合量達100mg純IgY. 　　8.純化——重組蛋白 重組蛋白在設(shè)計、構(gòu)建時應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產(chǎn)物，擴張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統(tǒng)。 　　一] GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。 　　2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達，以IgG Sepharose 6 FF純化。 　　二] 含組氨酸標記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。 　　9.純化——包涵體蛋白 　　包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學(xué)穩(wěn)定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復(fù)性至蛋白的天然構(gòu)象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復(fù)性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高。 　　10.包涵體蛋白固相復(fù)性 *近年許多文獻報導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后，蛋白在介質(zhì)上成功復(fù)性，再將復(fù)性好的蛋白洗脫下來。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過程中蛋白質(zhì)聚體的形成，所以復(fù)性得率更高，而且無需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時間及提高回收率。 　　*固相復(fù)性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。 　　11.純化——中草藥有效成分 　　中藥的化學(xué)成分極其復(fù)雜。傳統(tǒng)中藥多是煎熬后服用，有效成份多較為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，Z后是甙元。 Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。 　　*生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常近似的生物堿。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。 　　*一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex. 一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外，多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng) Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復(fù)數(shù)十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長。 　　12.純化——肽類 　　肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設(shè)計的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫(yī)學(xué)都市多功能 　　13.純化——核酸、病毒 　　核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和PCR產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。 　　 14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸多應(yīng)用在反義（anti-sense）DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。 　　15.脫鹽、小分子去除 　　使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%.只需在進樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可于數(shù)分鐘至半小時完成。Sephadex G25系列介質(zhì)專為蛋白質(zhì)脫鹽而設(shè)計，預(yù)裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作。HiPrep Desalting（26ml）可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。 　　16.疫苗純化 使用凝膠過濾介質(zhì)Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養(yǎng)基中的雜蛋白，處理量可大于床體積10%.柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。目前使用此法生產(chǎn)的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結(jié)核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。 　　17.抗生素聚合物分析 　　ZG藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產(chǎn)品的白分比，規(guī)定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。 　　18.純化-基因ZL用病毒載體 　　SORRCE 15Q 　　19.純化-基因ZL用質(zhì)粒 　　Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游純化中，可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時，去除各種污染物。 　　1.去除——內(nèi)毒素 　　內(nèi)毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復(fù)合大分子。 　　內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結(jié)合目標蛋白的介質(zhì)而去除內(nèi)毒素。 　　內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結(jié)合。可在洗脫目標蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。 　　利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。 　　2.去除——蛋白中的核酸 　　大量核酸增加樣本黏度，令區(qū)帶擴張，反壓增加，降低分辨率和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。 　　胞內(nèi)表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質(zhì)如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL結(jié)合目標蛋白，可除去大量核酸。 　　核酸在高鹽下會和蛋白解離，疏水層析介質(zhì)很適合用來結(jié)合目標蛋白，在純化蛋白的同時去除核酸。 　　利用核酸酶將核酸切成小片斷，用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。 　　3.去除——病毒和微生物 　　病毒和微生物可成為病原，應(yīng)盡量減除。結(jié)合不同層析技術(shù)，使用注射用水，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。 　　病毒大都有脂外殼?？捎门c目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用適當?shù)碾x子交換介質(zhì)如CM Sepharose FF結(jié)合目標蛋白，去除S/D. 　　其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質(zhì)Superdex及多種吸附性介質(zhì)，SOURCE都是很好的精細純化介質(zhì)，可去除多種微量污染物。 　　凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當?shù)臈l件下，整個體系會轉(zhuǎn)變成一種彈性的半固體狀態(tài)的稠厚物質(zhì)，失去流動性。這種現(xiàn)象稱為膠凝作用，所形成的產(chǎn)物叫做凝膠或凍膠. 　　“氣凝膠”是指分散系為氣態(tài)的，如：云，霧等，“固凝膠”有煙水晶等，“液凝膠”就是呈液態(tài)的膠體，如氫氧化鐵膠體 。 　　例： 　　食品級葡甘露膠（Gum Konjac-GM） 　　葡甘露膠（又稱：魔芋膠）系一種新型多用途微粒狀可食用膠。這里推出之葡甘露膠是以優(yōu)質(zhì)魔芋中提取的葡萄甘露聚糖為原料，經(jīng)脫雜處理后采用先進技術(shù)加工而成，其中添加成分不含任何非食用化學(xué)配料或色素。與傳統(tǒng)的瓊脂、果膠、海藻膠等食品添加劑相比，葡甘露膠在膨脹率、粘度、增稠、穩(wěn)定性及使用方便程度上皆顯著優(yōu)于上述膠類，此外尚具有特殊的優(yōu)點：無需添加任何凝固劑，在無糖、低糖或高糖條件下，在酸性、中性或堿性條件下，常溫即可凝凍，凝膠性能理想；保持或強化了葡萄甘露聚糖所具有的降糖、降脂、減肥等保健功能，大大拓寬了魔芋應(yīng)用的范圍；價格低廉、使用方便。 　　葡甘露膠能廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥、日用化工、科研等領(lǐng)域，作為瓊脂、果膠、海藻膠等的替代產(chǎn)品，價格低廉，且使用時無需改變原有的設(shè)備及工藝，能大幅度降低添加劑的使用成本，是一種理想的新型凝膠添加劑。為滿足不同產(chǎn)品開發(fā)的需要，一、凝膠（果凍）型：能與各種天然果汁、物料及色素良好混合，作為廣譜凝膠賦型劑，是制作果凍、水晶軟糖等的原料，也可作為培養(yǎng)基支持體，且不需再添加其它任何膠類或堿性成份；凝膠成型條件隨意、脫杯完整，凝膠強度高、韌性大。用量：0.7～0.9%。用法：在適量溫水中溶脹3～5分鐘，煮沸冷至70度左右時加入糖及各種配料，冷卻至室溫即成。 　　二、培養(yǎng)基型：用作替代瓊脂作為花卉及其它植物進行組織培養(yǎng)的支持體。組培苗根粗、苗壯，使用效果理想，成本大幅降低。用量：0.5～0.6％。用法：在溫水中溶脹3～5 分鐘，煮沸后冷卻即可。三、果肉（茶）飲料型：作為穩(wěn)定劑與懸浮劑，替代瓊脂和羧甲基纖維素等，廣泛用于粒粒橙、果茶、果汁、豆奶、銀耳羹、八寶粥等異相懸浮劑等（或混合）飲料中，防止沉淀或分層。 用量：0.15～0.25％左右。用法：在適量溫水中充分溶脹后加入物料中。四、冷凍制品型：用于冰棒、冰淇淋等各種冷凍制品，可增大膨脹，減少冰晶，提高抗熱融性，使產(chǎn)品更加爽口。用量：0.15～0.25％左右。用法：在適量溫水中充分溶脹后加入物料中。五、增稠型：用于果醬、米、面制品中，可增大膨脹率，提高韌性，改善賦型和口感。是進口洋槐豆膠的理想替代物。用量：0.2～0.3％左右。用法：在適量溫水中充分溶脹后加入物料中。

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