實驗室常用耗材匯總-離心管 八聯(lián)管 凍存管 本生（天津）健康科技有限公司供應(yīng)：移液器吸嘴，ELISA試劑盒，動物血清，全系熒光定量PCR耗材，產(chǎn)品包括：PCR單管、八聯(lián)管、96孔板、384孔板。

法國Stilla Technologies公司開發(fā)的—款多重PCR專用預(yù)混液：naica^?multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測。并對naica^?multiplex PCR MIX的多重檢測性能進行了詳細評估。當面對有限的樣本量時，可保證多重數(shù)字PCR檢測的靈敏度和準確性；在復(fù)雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。

★ naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進行6個靶標的同步準確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進行6個靶標的線性范圍分析，結(jié)果顯示6個靶標的R²均＞0.99，說明在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實現(xiàn)6靶標同步準確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預(yù)混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。

▲ 圖1：使用naica^?multiplex PCR MIX在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進行6個靶標的線性分析，分別在藍色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個通道進行檢測。每個稀釋點的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個稀釋度進行3次重復(fù)。結(jié)果顯示6個靶標的R2均大于0.99，說明所有靶標的結(jié)果都高度真實可靠。

★ 在復(fù)雜的背景基因下，對低豐度目的基因進行精確定量

數(shù)字PCR的—個重要技術(shù)優(yōu)勢是能夠在存在多個靶標擴增的情況下檢測到低濃度靶標。為了評估naica^?multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個目標DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進行檢測，同時其中摻入5種外部靶標模板（每個靶標的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結(jié)果均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A和2C)。這些結(jié)果與同一DNA 靶點在不同濃度下單獨檢測以及在不添加外部靶標的情況下獲得的結(jié)果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^?multiplex PCR MIX的擴增結(jié)果真實可靠。將pUC18質(zhì)粒（圖A和B)和pUC57質(zhì)粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個外部擴增靶標背景下（每個靶標為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(B,D)的情況下進行定量檢測，3次重復(fù)。線性擬合系數(shù) R2>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標的測定結(jié)果都是真實可靠的。5個外部靶標的相對標準偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復(fù)性。

★ naica^?multiplex PCR MIX應(yīng)用亮點

?  實現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測的高度穩(wěn)定性和高檢測靈敏度；

?  可在naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動態(tài)范圍內(nèi)同時定量檢測6個獨立的DNA靶標，均具有良好線性關(guān)系；

?  5X和10X的數(shù)字PCR預(yù)混液，提高了naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測能力；

?  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。

表1 naica^?multiplex PCR MIX貨號及規(guī)格

naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^?六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的拷貝數(shù)濃度。

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo?實時熒光定量PCR系統(tǒng)，融合了高品質(zhì)Pilter溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測系統(tǒng)，為您的科學(xué)研究提供高jing準、高靈敏的可靠結(jié)果。北京深藍云生物科技有限公司已經(jīng)為您準備好了儀器，期待您的SY哦~

既然儀器已經(jīng)備好了，那么該怎樣選擇檢測方法呢？

眾所周知，qPCR依托于熒光檢測技術(shù)，通過使用DNA結(jié)合染料、熒光PCR引物或探針等實時監(jiān)測目的基因的擴增，從而對目的基因進行定量分析。為了避免在實驗時出差錯，下面就跟著小編一起來看一下常用的經(jīng)典方法吧~

1、 DNA結(jié)合染料—SYBR Green I 法

?  原理：SYBR Green I 是一種DNA結(jié)合染料，其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強，DNA與染料結(jié)合所釋放的熒光量與dsDNA的數(shù)量成正比。因此，檢測到的熒光信號可反映出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

?  特征：可逆熒光，Z大吸收波長497nm，Z大發(fā)射波長520nm。

?  適用情況：非特異性的熒光染料，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈（包括非特異性擴增產(chǎn)物、引物二聚體等）就會結(jié)合發(fā)光，在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。但該方法容易建立實驗體系，可進行熔點分析，通用性好，價格相對較低，在科研中使用比較普遍。

2 、TaqMan 探針法

?  原理：檢測時除了需要一對特異性引物外，還需要一條與靶序列互補配對的寡核苷酸鏈—TaqMan探針，其5’末端包含熒光報告基團R，3’末端為淬滅基團Q。當探針與靶序列互補配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而淬滅。在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’核酸外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。熒光信號和產(chǎn)物的量相匹配。

?  特征：檢測到的是積累熒光，隨著循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。

?  適用情況：特異性較強，可進行多重qPCR分析，但成本較染料法要高一些，實驗構(gòu)建相對復(fù)雜。常用的熒光基團推薦：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信標(molecular beacon)

?  原理：分子信標方法在檢測時除了需要一對引物以外，還需要一條呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針（25-40nt），分子信標的 5'端附有熒光報告基團，3'端附有淬滅基團，環(huán)被設(shè)計成與靶序列互補的15–30核苷酸，其兩端各有5-7個核苷酸互補形成莖結(jié)構(gòu)，將報告基團與淬滅基團連接到一起。發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，由于報告基團接近淬滅基團，監(jiān)測不到熒光信號，當環(huán)的部分與核酸序列互補配對，分子信標打開成鏈狀，使得熒光基團與淬滅劑分開，發(fā)射熒光。

?  特征：莖環(huán)結(jié)構(gòu)，也是積累熒光。

?  適用情況：高特異性、可以用于多重反應(yīng)，適合區(qū)分等位基因。但不能做熔點分析；發(fā)夾的莖結(jié)合過強過弱都不合適，過強的話，信標不能與靶標正確雜交，過弱的話，會隨機折疊成非發(fā)夾結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致產(chǎn)生雜信號。常用的熒光基團有FAM 、Texas Red等。

4  、熒光共振能量傳遞(FRET)

?  原理：FRET探針又稱雙雜交探針，由兩條相鄰探針組成。一個探針3'端帶有供體基團，第二個探針的5'端帶有受體基團，在PCR反應(yīng)的退火步驟，兩條探針頭尾相連地分別雜交在靶標序列上，熒光分子接近，從供體到受體產(chǎn)生熒光共振能量傳遞，受體熒光信號的增加與擴增子出現(xiàn)的量成比例。

?  特征：由于FRET探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，而非積累熒光。

?  適用情況：除引物外需要設(shè)計兩條探針，通用性不高；需挑選合適的供體及受體基團，供體基團發(fā)射波長與受體基團的激發(fā)波長需顯著重疊，而供體基團發(fā)射波長與受體基團的發(fā)射波長要明顯分離。可做熔點分析，特異性較強。

5 、 LUX Primers

?  原理：LUX (light upon extention) 引物是通過熒光標記的引物，使引物可以實現(xiàn)探針的功能。其原理和分子信標類似，LUX引物也是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中一條引物3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生熒光信號。

?  特征：積累熒光；不需要額外設(shè)計探針。

?  適用情況：不能進行熔點分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要專門設(shè)計探針，同時不會受非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體的影響，特異性較SYBR Green I強。

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看完了上面關(guān)于經(jīng)典qPCR檢測方法的介紹，您是不是有想去跑一輪qPCR的沖動呢？

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?   數(shù)據(jù)可靠性: 連續(xù)1000次實驗后，結(jié)果高度一致，溫控jing準，性能穩(wěn)定可靠。

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