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  jmbmbmbmbm 2017-04-17 00:00:00

  具有平末端或5;-突出末端的雙鏈線性DNA可作為體外轉(zhuǎn)錄模板。線性化的質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或cDNA只要含有雙鏈RNA聚合酶啟動子且方向正確均可用作轉(zhuǎn)錄模板。 不同RNA聚合酶的同源啟動子序列： T7 TAATACGACTCACTATA (+1)GGG T3 AATTAACCCTCACTAAA (+1)GGG SP6 ATTTAGGTGACACTATA (+1)GAA G (+1)是RNA轉(zhuǎn)錄的起始位點正義還是反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的合成依賴于啟動子的方向(相對于目標序列)。正義RNA合成要求目標序列置于啟動子的下游，而反義RNA的合成則恰好相反。 質(zhì)粒模板 質(zhì)量 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量和合成RNA的完整性。Z高純度的質(zhì)粒模板可獲Z大的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量。常規(guī)實驗方法純化的DNA如果沒有RNases、SDS、EDTA、蛋白質(zhì)、鹽類* 和RNA污染即可用作轉(zhuǎn)錄的模板。轉(zhuǎn)錄用DNA模板A260/280比值應在1.8-2.0之間。GeneJET8482; Plasmid Miniprep Kit (K0502)可制備高純度的轉(zhuǎn)錄用DNA。 * 當NaCl或KCl的濃度超過150 mM時，T7和SP6 RNA聚合酶的活性~50%被YZ；當NaCl或KCl的濃度超過250 mM時，T3 RNA聚合酶的活性~50%被YZ。 線性化 如需獲得特定長度的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可在插入位點下游選擇合適的限制酶(切割產(chǎn)生平末端或5’-突出末端為佳)切割質(zhì)粒DNA使之線性化。有報道指出3’-突出末端可能會引起錯誤轉(zhuǎn)錄(1)，應盡量避免。3’-突出末端可在轉(zhuǎn)錄前經(jīng)T4 DNA聚合酶(EP0061)處理平端化。 由于RNA聚合酶具有很高的持續(xù)合成能力，環(huán)狀質(zhì)粒模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同種類長片段RNA轉(zhuǎn)錄子的產(chǎn)量比線性質(zhì)粒模板高。因此質(zhì)粒徹底線性化對確保有效合成特定長度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物非常重要。如果不能徹底酶切，轉(zhuǎn)錄前可考慮凝膠回收(如DNA Gel Extraction Kit (K0513))線性化DNA。線性化后，酚/氯仿抽提純化DNA模板： （1）加入1/10體積3M醋酸鈉溶液(R1181)到DNA溶液中。 （2）徹底混勻。 （3）加入等體積酚/氯仿混合物(1:1比例)抽提后再用等體積氯仿抽提兩次。收集水相轉(zhuǎn)移至新離心管。 （4）加入2倍體積乙醇沉淀DNA，-20°C靜置至少30分鐘，離心收集沉淀。 （5）棄上清，加入500 μl 70%冰乙醇漂洗沉淀。 （6）加入20 μl DEPC處理水(R0601)重懸DNA。 PCR模板 PCR產(chǎn)物可作為體外轉(zhuǎn)錄模板。RNA聚合酶啟動子要求定位在待轉(zhuǎn)錄序列的上游。 常規(guī)體外轉(zhuǎn)錄 采用以下操作方法可從1 μg DNA模板中制備10 μg RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應體系可以放大或縮小。如需高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄制備多達200 μg的RNA轉(zhuǎn)錄子，請選用TranscriptAid8482; T7 High Yield Transcription Kit (K0441)。 解凍凍存的試劑，混勻后短暫離心。 酶蛋白和核苷酸需冰上放置。 反應緩沖液需室溫放置。 1 室溫配制以下反應體系： 5X 轉(zhuǎn)錄緩沖液 10 181;l ATP/GTP/CTP/UTP Mix， 10 mM each 10 181;l (終濃度2 mM) 線性化模板DNA 1 181;g RiboLock8482; RNase Inhibitor 1.25 181;l (50 u) T7 RNA Polymerase（點擊黃顏色查看產(chǎn)品詳情） 或T3 RNA Polymerase 或SP6 RNA Polymerase 1.5 181;l (30 u) DEPC處理水 (R0601) 至 50 181;l 總體積 50 181;l 2 37°C孵育2小時。 3 可選：加入2 μl (2 u) DNase I， RNase-free (EN0521)，混勻后37°C孵育15分鐘除去DNA模板。 4 加入2 μl 0.5 M EDTA， pH 8.0 (R1021)，65°C孵育10分鐘終止反應。 備注 無螯合劑存在時，加熱會導致RNA的水解

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