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  社會小伙你 2016-12-02 02:21:55

  實驗方法 1．瓊脂糖活化 ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。 ⑵ 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH，使pH保持在11左右，反應(yīng)10min。在1min~2min迅速調(diào)整pH為8.0～11.0維持10min。 ⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。 2．偶聯(lián)蛋白 20ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。 ⑴ 事先將需偶聯(lián)的抗原（或抗體）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體)。 ⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián)），4℃緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。 3．裝柱 ⑴ 選柱：不宜過大，一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。 ⑵ 裝柱：將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。 ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD280＜0.02為止。 收集全部的洗脫液，測得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此可計算偶聯(lián)率。 4．吸附與解吸附 ⑴按床體積1/10加樣，濃度為1％～2%，緩慢加入待純化的抗體（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD280＜0.02為止。 ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。 5．以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷凍和干裂。 6．結(jié)果判定 ⑴ 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進(jìn)行純度鑒定。 ⑵ 將純度好的各管洗脫液合并，以生理鹽水透析，然后濃縮或凍干保存。

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