菲羅門與ACE色譜柱的保養(yǎng)方法

色譜柱是一種消耗品，因此使用壽命有限。

對于大多數(shù)應用，色譜柱應持續(xù)進行500-2000次注射（進樣），但這會因樣品的清潔度、流動相的pH值和保護柱卡套的使用（是否使用保護柱）而不同。

這里列出的做法有助于Z大限度地提高硅基（硅膠基質）色譜柱的使用壽命。

一、色譜柱的平衡：當從一個流動相更換為另一個流動相時，或者在回收梯度（梯度循環(huán)）時，應需要10-20個柱體積。

下表顯示了各種色譜柱尺寸（規(guī)格）的色譜柱體積。

如果溶劑的變化不太劇烈（例如80％至20％的ACN/水與ACN至THF（與之相對的由ACN至THF）），則需要的體積較少。

檢查平衡Z簡單方法是進行兩次樣品注射。

如果保留相同，則色譜柱充分平衡；如果保留變化，應增加平衡體積并重新試驗。平衡與溶劑的體積有關，與時間無關。

所以較高的流量（流速）可以減少平衡時間。

                                        近似的色譜柱容量（mL）

二、色譜柱沖洗是一個簡單的過程，可以通過清洗色譜柱中的頑固（保留較強的）物質來延長色譜柱的壽命。

每天結束色譜柱的使用時，應除去一切緩沖液（應除去色譜柱中的緩沖鹽），然后用100％強溶劑（通常為ACN或MeOH，采用反相方法）沖洗色譜柱。

下一頁列出的詳細沖洗程序可以有效恢復色譜柱的性能，但應牢記：色譜柱是一種消耗品，因此請勿期望它能夠永遠的持續(xù)使用！

避免用100％的水沖洗反相色譜柱（嵌入極性基團或“AQ”色譜柱除外），因為相（固定相）去濕會影響清洗效果，而且流動相色譜柱的重新平衡會非常緩慢。

對于您的色譜柱，請按照以下所述的一般步驟，使用特定溶劑進行色譜柱沖洗。

應在沖洗之前查看制造商的建議（生產商說明書），以免損壞色譜柱。
1. 拆掉并翻轉色譜柱（拆下色譜并反接）
2. 將色譜柱連接到泵上，而非檢測器（不接檢測器）
3. 用10-20個柱體積的溶劑進行沖洗，且流速不得高于QC色譜圖的流速
4. 如果改變以下步驟，應確保在每個連續(xù)步驟中使用可混溶溶劑（溶劑可互溶）

反相色譜柱（C18，C8，C4，苯基，CN，'AQ'型）
a. 流動相無緩沖液
b. MeOH或ACN

如果金屬離子被認為是污染的致因，應使用0.05M EDTA水溶液沖洗，然后用水沖洗，并按上述順序沖洗。使用離子對試劑的色譜柱應專門用于離子對的應用之中。

未鍵合的硅膠柱（SIL）
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

鍵合正相柱（CN、NH 2、二醇）
a. 三氯jia烷
b. IPA
c. 二氯jia烷
d. 己烷

陰離子交換柱（SAX，WAX）
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯jia烷
d. 甲醇
e. 水

陽離子交換柱（SCX，WCX）
a. 水（沖洗時注入4x200L的DMSO）
b. THF

蛋白質的體積排阻柱
對于弱保留的蛋白質
a. 0.1M磷酸鹽緩沖液，pH為3
對于強保留的蛋白質
a. 100％水至100％ACN的梯度，運行60分鐘

三、色譜柱的合理存放有助于延長柱的使用壽命。

Z簡單的存放步驟為：從柱中除去一切緩沖液，然后用10-20個柱體積的強流動相溶劑（例如用于反相的MeOH或ACN）清洗柱，以除去柱中的頑固（強保留）物質。

然后用制造商指定的存儲流動相，以10-20個柱體積的容量沖洗色譜柱（該信息應隨色譜柱提供，并在QC檢測色譜圖中進行詳細的說明）。

Z后，安全地蓋上柱帽（擰緊堵頭），以防流動相蒸發(fā)。
除了色譜柱制造商明確建議的特定情況（例如一些離子交換柱）外，請勿使用緩沖液或者少于約25％的有機溶劑來用于儲色譜柱存儲，因為它們會導致微生物的滋生。（保存色譜柱，以防微生物的滋生）

菲羅門色譜柱選擇卡

氨基酸作為構成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。
隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動相對其保留很弱，同時部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動相和檢測器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結廣州菲羅門積累經(jīng)典色譜應用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析四種廣受關注的應用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個難點：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團，可以實現(xiàn)在C18柱+反相流動相的體系下進行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當選擇氨基酸非衍生直接分析時，對于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實現(xiàn)保留，當使用磷酸鹽類時，可以在截止波長條件下用UV檢測，比較經(jīng)典的應用是用ACE HILIC-B檢測門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS為檢測器的條件下分析氨基酸。

三、保護型氨基酸手性分析

當氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護起來時，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開發(fā)的時間。

四、非保護氨基酸直接手性分析

對于非保護的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實現(xiàn)了有機酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結: 本文全面總結了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析。

對于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術工程師。

氨基酸作為構成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。

隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動相對其保留很弱，同時部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動相和檢測器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結廣州菲羅門積累經(jīng)典色譜應用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析四種廣受關注的應用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個難點：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團，可以實現(xiàn)在C18柱+反相流動相的體系下進行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當選擇氨基酸非衍生直接分析時，對于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實現(xiàn)保留，當使用磷酸鹽類時，可以在截止波長條件下用UV檢測，比較經(jīng)典的應用是用ACE HILIC-B檢測門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS為檢測器的條件下分析氨基酸。

三、保護型氨基酸手性分析

當氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護起來時，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開發(fā)的時間。

四、非保護氨基酸直接手性分析

對于非保護的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實現(xiàn)了有機酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結: 本文全面總結了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析。

對于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術工程師。

色譜柱ACE

由廣東省藥學會策劃執(zhí)行的2019第二屆藥物雜質分析分離學術研討會在廣州圓滿召開。

本次會議得到了廣州菲羅門、暨南大學、華南師范大學、島津、研創(chuàng)、等有關單位的大力支持，為期兩天的論壇共吸引行業(yè)人員300余人參加。

其次，還對藥物中《基因毒雜質的分析》等有關話題分享了經(jīng)驗心得，就制藥行業(yè)實驗的發(fā)展與形勢展開探討，同時提出了色譜分析環(huán)節(jié)中的重要性以及實踐戰(zhàn)略與技術方案。

ACE? Excel? 色譜柱

ACE Excel 2μm UHPLC色譜柱

• 與所有市售UPLC和UHPLC儀器完全兼容

• 為UHPLC色譜柱提供口碑zhuo越的ACE HPLC色譜柱優(yōu)勢

• 為UPLC/UHPLC使用者提供了更多選擇的固定相，包括強大的C18-AR和C18-PFP相

• 提供高水平的可靠性和耐用性

• 提供從UHPLC到HPLC再至制備型LC的易擴展性

• 適用于UHPLC的2、3和5μm粒徑

制造UHPLC色譜柱是比較困難的，且通常認為它們不像HPLC色譜柱那樣耐用和可靠。

憑借其在制造Z優(yōu)質HPLC色譜柱方面的豐富經(jīng)驗，Advanced Chromatography Technologies能夠生產出非常可靠的UHPLC色譜柱。

現(xiàn)在，色譜分析師將從UPLC和UHPLC儀器中獲得更多的成果。UPLC和UHPLC使用者利用ACE ExcelUHPLC色譜柱現(xiàn)可以獲得堿性化合物的峰形、改善柱間的可重現(xiàn)性、獲得利用多種分離機制的附加固定相以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel提供zhuo越的分離度和峰形

條件
流動相A = 5mM甲酸（溶于水中）和B = 5mM甲酸（溶液甲醇中）梯度5分鐘內3-100％B
流速：0.6 ml/min
溫度：40 ℃
檢測：UV, 254 nm
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm

Analytes
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯基砜
5. 阿司匹林

6. 非那西丁
7. 1,3-二硝基苯
8. 1,2,4-三甲氧基苯
9. 苯甲酸乙酯
10. 尼美舒利

11. 布洛芬
12. 吲哚美辛
13. 甲芬那酸

這些比較性色譜圖顯示，C18鍵合相不能將所有13種分析物完全分離。由于其額外的分離機制，ACE Excel C18-PFP能夠基線分離所有分析物。

備注：比較性分離物不代表所有應用。

ACE?是Advanced Chromatography Technologies Limited的注冊商標。
ACE ExcelTM和HSCTM是Advanced Chromatography Technologies Limited的商標。
Advanced Chromatography Technologies Limited承認Advanced Scientific Instruments、Agilent Technologies Inc.、Alltech AssociatesInc.、GL Sciences Inc.、Idex Health＆Science LLC、Phenomenex Inc.、Shimadzu Corporation、Thermo Fisher Scientific和Waters Corporation的注冊和未注冊商標，且與上述這些公司沒有任何隸屬關系。

ACE Excel UHPLC色譜柱與所有市售UPLC和UHPLC儀器兼容

Thermo Scientic Accela

Dionex UltiMate 3000

Waters

• Acquity UPLC

• Acquity UPLC H–Class

• Acquity UPLC I–Class

安捷倫科技

• 1290 Infinity

• 1220 Infinity

• 1260 Infinity
  

• 1200 Infinity

島津

• Nexera

• Prominence

加上許多其他品牌的UHPLC儀器，恕不能一一列舉

核苷酸專用柱是什么柱？菲羅門為您解答

核酸堿基、核苷和核苷酸的HPLC分析

核苷是由含氮堿基與核糖或脫氧核糖縮合而成，核苷與磷酸合成核苷酸。核苷酸主要參與構成核酸，在人體內廣泛分布，具有多種生物學功能，如與能量代謝有關的三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。

為滿足不同物質的分離要求，菲羅門推薦多款色譜柱對其進行HPLC分析。

一、 核苷異構體的分離

1.β-胸苷（dT）與α-胸苷的分離

ACE C18-AR是一種獨特的C18鍵合的HPLC色譜柱，結合了C18烷基鏈的疏水作用和苯基的芳香選擇性，而且可以耐水相，非常適合芳香化合物的分離。

色譜條件：

色譜柱ACE Excel C18-AR 5μ 150 × 4.6 mm

貨號：EXL-129-1546U

2.尿苷和阿糖尿苷的分離

ACE C18-Amide是一款嵌入極性酰胺基團的C18柱，相當于同時具備C18與酰胺基的選擇性，同樣耐水相，很適合分析含氫鍵給體的物質。

色譜柱：ACE Excel C18-Amide 3μ 100 X 4.6 mm

貨號：EXL-1112-1046U

二、 核酸堿基和核苷的分析

ACE HILIC-N是ACE三款親水作用色譜柱中的中性柱，相對于陰陽離子都顯示出較低的離子交換能力，通過極性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）來保留分離核酸堿基、核糖核苷和脫氧核糖核苷。

色譜柱：ACE HILIC-N 5μ 150 X 4.6 mm

貨號：HILN-5-1546U

三、 核酸堿基、核苷和核苷酸的分析

Titank C18有機硅膠雜化色譜柱，是在硅膠的硅氧網(wǎng)狀構造中以更加穩(wěn)定的烷基來取代在堿性條件下不穩(wěn)定的硅氧橋連接，具有寬pH耐受范圍（1-12）、低背壓和水相穩(wěn)定的特點，對于較大極性的物質有很好的保留。

色譜柱：菲羅門 Titank C18 3μ 50 × 3.0mm

貨號：FMB-5559-YONU

四、 單磷酸核苷酸的分離

ACE NH2是氨丙基鍵合的硅膠柱，與ACE其它固定相的色譜柱一樣，都是采用超惰性的硅膠制成，具有很好的穩(wěn)定性和使用壽命。

色譜柱：ACE Excel 3μ NH2

貨號：EXL-1114-1546U

五、 九種核苷酸的分離

Comixshell AIRP是陽離子嵌入烷基鍵合的核殼硅膠柱，同時具有反相和陰離子交換選擇性，是Comix系列色譜柱中的一種。

Comix系列色譜柱可以用來同時檢測無機和有機化合物、分離大極性物質及復雜體系。

色譜柱：菲羅門 Comixshell AIRP 2.7μ 150 × 4.6 mm

貨號：FMF-AIRP-EONU

總之，不同的疏水性或是極性作用力的固定相可以提供不同的選擇性，所以選擇正確的固定相是至關重要的一步。

市場常見色譜柱惰性比較

• lingxian的3μm、小孔徑C18色譜柱品牌

• 50 x 2.1 mm i.d.LC/MS兼容尺寸

• 堿性分子惰性測試

• 峰柱效和不對稱性研究

峰柱效比較  

結論
當分析吡啶（一種高堿性小分子）時，可以看到柱效、峰形和選擇性的顯著差異。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相上表面的硅醇基之間存在不受歡迎的次級相互作用。

這些相互作用也可能導致色譜柱可重現(xiàn)性不佳。
之前已對ACE C18色譜柱進行了獨立測試，發(fā)現(xiàn)具有出色的柱效和ji致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了這一優(yōu)異性能。

ACE?固定相幾乎消除了硅醇基對HPLC分離的不利影響

進一步的惰性測試數(shù)據(jù)包含在ACE HPLC色譜柱目錄中。

此外，還提供了C18柱比較指南，其詳細介紹了超過50種HPLC色譜柱品牌的材料特性，并將性能與許多測試探針進行了比較。

請聯(lián)系菲羅門索取資料。

ACE色譜柱保護柱安裝使用說明

ACE獨立式保護柱套是專為內徑為1.0 - 4.6mm 的 ACE HPLC色譜柱而設計的，與ACE柱耦合器 (C0001)配合使用。

ACE色譜柱保護柱安裝使用說明

1. 將保護柱芯放入柱套螺紋較短的那一半內。

保護柱芯是非定向的。

2. 用手將兩半的柱套擰緊直至感覺到阻力為止，

然后再用扳手擰緊四分支一圈。

3. 將柱套螺旋紋較短的那一端與手擰柱耦合器  (C0001)一起連接到分析柱上。

這里請用手擰緊，千萬不要用扳手。

4. 如果在加壓后，兩半柱套之間發(fā)現(xiàn)有滲漏的情況，請用扳手小心地將兩半稍稍擰緊，直到滲漏 停止。

5. 如果在加壓后，柱子和保護柱套之間有任何滲漏的情況，請用手小心地擰緊直到滲漏停止。

6. 柱耦合器(C0001)的活動中軸是自適應無實體積匹配各種色譜柱頭，切勿抽出遺失。切勿讓該配件非均 勻受力，以免折斷。

ACE HILIC法開發(fā)平臺和工作實例

圖17顯示了HILIC方法開發(fā)的流程圖。
一般方法是：收集分析物相關的信息（如果已知的話），針對三個ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色譜柱在不同的pH洗脫液條件下）執(zhí)行梯度或等度HILIC篩選實驗（取決于樣本分析物的親水性范圍），然后再優(yōu)化色譜法以達到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC篩選條件。

這些設計旨在探索廣泛的選擇性范圍，以及為達到所需分離提供一個良好的起點。

圖17
ACE HILIC 方法開發(fā)流程圖

表1
ACE HILIC篩選實驗的條件

ACE HILIC色譜柱保存方法

使用之后，ACE HILIC色譜柱應使用體積比為7:3的乙腈和水進行沖洗，清除掉所有的緩沖鹽。

然后，使用的異丙醇、以更低的流速進行沖洗，以便貯存。應往回擰緊色譜柱端蓋（擰緊色譜柱端蓋），并將色譜柱放回盒內。

每次分析運行之后，除非第二天要使用，否則建議采用密閉法（按長期保存的方法）清洗色譜柱，然后用異丙醇沖洗。

實例1 – 咖啡茵和相關化合物

方法開發(fā)中所需的咖啡茵和四種相關化合物（可可堿、茶堿、次黃嘌呤和黃嘌呤）這些化合物都是極性的中性物質，其中負log P值表示合理的親水性（log P為負值明確的表明其親水性），因此適用于HILIC（圖18）。

圖18
咖啡茵和相關物質的結構和log P數(shù)據(jù)

咖啡茵和相關化合物在pH為3-6的情況下不可電離，因此洗脫劑的pH幾乎不會直接影響分子。

為此，選擇pH 3.0和4.7。

固定相會受洗脫劑pH變化的影響，這可能是有利的一面。

固定相的電離變化將影響粒子周圍的水合層，這會影響分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氫鍵的程度。

因此，在pH3.0和pH4.7的情況下對三個固定相進行篩選，結果如圖19中所示。
新的ACE HILIC色譜柱使用60倍柱體積相互平衡（平衡），以在粒子周圍形成水合層。表1中顯示了流動相、梯度和溫度。
篩選結果顯示：三個固定相與兩個pH值之間觀察到一些選擇性差異（三個固定相在兩個pH值下的篩選結果可以看出彼此間具有選擇性的差異）。

基于篩選數(shù)據(jù)的Z有效分離是針對pH為3.0下的（pH為3.0下的）ACE HILIC-N相。

這些數(shù)據(jù)選擇（選定這些條件）用于進一步優(yōu)化。

圖19
ACE HILIC色譜柱的梯度篩選

條件如表1中所述，275nm條件下的檢測除外。進樣25mg/mL的咖啡茵混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸銨，以0.5%w/w的比例混合相關物質和MeCN/H2O（90:10 v/v））
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

較早洗脫峰的保留窗口（時間段）非常窄，這表示：等度HILIC可用于分離分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分離這些化合物）10mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被選為等度條件（圖20）。

在這些條件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分離）。
根據(jù)梯度運行的結果，乙腈含量更高似乎不會提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量沒有提高2與3峰的分離度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是對混合物分離有更合適的，溫度將被研究），從而開發(fā)出Z終方法，如圖21所示。

圖20
ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關化合物的等度分析

ACE HILIC-N相中咖啡茵和相關化合物的等度分析
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 275 nm
進樣：2 μL
樣本：
1) 咖啡茵

2) 茶堿
3) 可可堿
4) 黃嘌呤
5) 次黃嘌呤

溫度的降低會提高茶堿與可可堿之間的解析度（分離度），因此，Z終方法（圖21）被認為適合其用途。

圖21
Z終開發(fā)方法：

色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：A = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-B在15分鐘內，B持續(xù)5分鐘，下一次進樣維持在起始條件20分鐘
流速：1.5 mL/min
溫度：15 °C
檢測：275 nm
進樣：2 μL

實例2 – 肌酸和肌酐

肌酸（圖22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。

它在為體內細胞提供能量方面起著重要作用（在體內主要用于為細胞供能），并形成（生成）副產品肌酐。測定血液中的肌酐，確定腎功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示腎可能不會完全過濾廢物。（升高表明腎的過濾廢物的功能有所降低）

圖22
結構和log P肌酸和肌酐數(shù)據(jù)

圖23
使用pH為3.0、4.7和6.0的甲酸銨對ACE HILIC范圍的等度篩選對比
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

在三種pH值條件下，利用等度條件對三個HILIC固定相的兩種分析物進行篩選。

結果表明：肌酐在三個ACE HILIC相中被適當?shù)乇Ａ?，但由于過度保留的原因，肌酸在合理的時間內沒有洗脫。

根據(jù)圖17中的流程圖，過度保留窗口表示梯度（寬時間段表明梯度方法）可能更適宜。

圖24
ACE HILIC-A相下的Z終方法

ACE HILIC-A在pH3.0下選擇，進行梯度分析。

標準梯度在10分鐘內析出兩種目標分析物，并且解析度很高（分離度很高）（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，這使得梯度時間進一步減少（這種情況下可以使梯度運行時間進一步減少），從而縮短了整體運行時間。

Z終方法如圖24中所示。

色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動相：
A：2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸銨（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分鐘內
流速：1.5 mL/min
檢測：230 nm
進樣：5 μL
樣本：
1) 肌酐
2) 肌酸

結論

HILIC是一種用于多用途的極性分析物色譜分析法（對于極性化合物來說是一種通用的色譜分析模式）。

這種方法比較復雜，但如果遵循簡單規(guī)則，則可實現(xiàn)可再現(xiàn)的HILIC方法（HILIC方法是可以重現(xiàn)性的）。

三個ACE HILIC相（固定相）設計用于HILIC方法開發(fā)期間研究選擇性，并盡可能快地提供實現(xiàn)所需分離的選項。

ACE HILIC方法驗證協(xié)議（規(guī)程）已成功用于開發(fā)一系列的HILIC方法，應為HILIC方法開發(fā)活動提供一種結構化的方法。