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  z654527 2009-03-10 00:00:00

  雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實(shí)驗(yàn)室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實(shí)驗(yàn)室采用的、實(shí)踐證明成熟的程序，該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。 在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測(cè)的儀器設(shè)備，依據(jù)檢測(cè)單抗的方法不同而各異，請(qǐng)參閱本節(jié)有關(guān)部分。 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測(cè)、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過程。 1、動(dòng)物免疫 (1) 抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶?，?yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對(duì)抗原進(jìn)行純化。檢測(cè)用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。 (2) 免疫動(dòng)物的選擇根據(jù)所用的瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。但是，有時(shí)為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動(dòng)物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時(shí)以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。 (3) 免疫程序的確定免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機(jī)會(huì)。因此在設(shè)計(jì)免疫程序時(shí)，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對(duì)該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個(gè)免疫程序能適用于各種抗原。現(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。Z后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕?duì)脾細(xì)胞作用更迅速而充分。在Z后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞 融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會(huì)陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到Z高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在Z后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報(bào)道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對(duì)抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時(shí)間，一般免疫3天后即可融合。 表6-1 不同免疫抗原的免疫程序 免疫原特性 抗原量 接種次數(shù) 間隔時(shí)間 單抗的特性 抗體滴度 親和性 免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等） 106-107個(gè)細(xì)胞或1-10ug 2-4 2-4周 高 中等至強(qiáng) 免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高中等或強(qiáng) 免疫原性弱 A.20-400ug 2-4 隨后 2-3 每月 2-3月中等 強(qiáng) B.10-50ug 其后 200-400ug 2 其后 4 每月 每天 中等 中等 C.10-100ug 2 其后 4 其后“休息” Z后加強(qiáng) 每月 10天 1-2月 中等 中等或強(qiáng) 體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、來源充分的抗原，對(duì)于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫YZ）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對(duì)這些情況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周血淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細(xì)胞抗原105-106個(gè)細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞融合。 2、細(xì)胞融合 （1） 主要試劑的配制 a、 細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾CJ（0.22um），分裝，4℃保存。 "不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml 100×L.G.溶液1ml 雙抗溶液1ml 7.5% NaHCO3溶液1-2ml HEPES溶液1ml "不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM 13.37g 超純水或四蒸水980ml NaHCO3 3.7g 雙抗溶液10ml 100×L.G.溶液10ml 用1N HCl調(diào)試PH至7.2-7.4，過濾CJ，分裝4℃保存。 "完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基80ml 小牛血清15-20ml 用于瘤細(xì)胞SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。 "HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基99ml HT貯存液1ml "HAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98ml HT貯存液1ml A貯存液1ml b、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100ml。過濾CJ，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。 c、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×，H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine，MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine，MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾CJ，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。 d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾CJ，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。 e、 青、鏈霉素（雙抗）溶液（100×）: 取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g，溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。 f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾CJ，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。 g、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾CJ，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。 h、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過濾CJ；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時(shí)按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。 g. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保溫2小時(shí)，加甲醇33ml混勻，保存于棕色瓶內(nèi)作為原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。 h. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細(xì)胞進(jìn)行觀察分析。每份標(biāo)本應(yīng)計(jì)數(shù)100個(gè)完整的中期核細(xì)胞，并注意觀察是否有標(biāo)志染色體。 i、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5% NaHCO3調(diào)PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。 ⑵ 髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 融合前瘤細(xì)胞維持的方式，對(duì)成功地得到雜交瘤是Z為重要的。目標(biāo)是使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長的時(shí)間盡可能長，融合前肯定不能少于1周。凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時(shí)間才能處于適合于融合的狀態(tài)，長過了的瘤細(xì)胞至少幾天才可能恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)室中處于對(duì)數(shù)生長的瘤細(xì)胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個(gè)裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的瘤細(xì)胞。1周后到細(xì)胞相當(dāng)密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時(shí)間為14-16小時(shí)。 瘤細(xì)胞懸液的制備方法如下： a、于融合前48-36小時(shí)，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗(yàn)約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備）。 b、融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。 c、 1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。 d、加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。 e、取瘤細(xì)胞懸液，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml加入0.9ml臺(tái)盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)=4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)×105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)×106/2 ⑶ 脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽性對(duì)照血清。同時(shí)通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺(tái)板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到，換眼科剪鑷，在超凈臺(tái)中用無菌手術(shù)剪剪開腹膜，取出置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓（也可用注射器內(nèi)芯擠壓），使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可用200目銅網(wǎng)過濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺(tái)酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠可得5×108-10×108脾細(xì)胞。 ⑷ 飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells）的制備 在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用Z為普遍。其制備方法如下： 按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2×105/ml，備用。通常對(duì)巨噬細(xì)胞來說，96孔培養(yǎng)板每孔需2×104個(gè)細(xì)胞，24孔板每孔需105細(xì)胞。每只小鼠可得3-5×106個(gè)細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細(xì)胞。也可在細(xì)胞融合前1-2天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細(xì)胞層。做法是，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當(dāng)于2滴），然后置37℃ 6% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ⑸ 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 細(xì)胞融合的程序已報(bào)道的有很多種，這里介紹的是作者所在實(shí)驗(yàn)室常用的一種。 A、將1×108脾細(xì)胞與2×107-5×107瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。 B、 1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。 C、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻;置40℃水浴中預(yù)熱。 D、用1ml吸管在1分鐘左右（Z佳時(shí)間為45秒）加預(yù)熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。 E、用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至37℃的不完全培養(yǎng)基；20-37℃靜置10分鐘。 F、 1000r/min 5分鐘；棄去上清。 G、 加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80-100ml。 H、分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將培養(yǎng)板置37℃，6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 I、 5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。 J、 7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。 L、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清供抗體檢測(cè)。 3、雜交瘤細(xì)胞篩選 雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測(cè)?？贵w檢測(cè)的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測(cè)方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào)告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測(cè)方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測(cè)方法，并克服可能存在的問題。另一個(gè)重要問題是抗體檢測(cè)方法所需要的“動(dòng)力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的Z強(qiáng)與Z弱信號(hào)之比，依所用的檢測(cè)抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對(duì)純化的蛋白質(zhì)抗原的，的抗原參與反應(yīng)，一個(gè)陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對(duì)細(xì)胞表面微量的蛋白抗原，檢測(cè)系統(tǒng)可能需要能測(cè)出微弱信號(hào)，則動(dòng)力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，Z好為100：1。另外，檢測(cè)方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測(cè)方法來選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測(cè)方法。 下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測(cè)方法： ⑴ 免疫酶技術(shù) 免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的GX催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。 A、器材和試劑 a. 包被緩沖液： 碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)PH至9.6。 Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。 b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。 c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。 d. 酶反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。 e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。 f. 底物使用液： OPD底物使用液（測(cè)490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。 TMBS或TMB底物使用液（測(cè)450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。 ABTS底物使用液（測(cè)410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。 g. 抗體對(duì)照：以瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽性血清。 h. 抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。 病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。 淋巴細(xì)胞等懸液。 i. 酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類似試劑。 j. 細(xì)胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。 k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。 l. 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。 m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。 B、 可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。 b. 以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時(shí)。 c. 棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。 d. 每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原，可省略。 e. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩? f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37℃孵育1-2小時(shí)；洗滌，拍干。 g. 加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時(shí)，洗滌，拍干。 h. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鐘。 i. 以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。 j. 結(jié)果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D為陽性。若陰性對(duì)照孔無色或接近無色，陽性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。 C、 全菌抗原的ELISAS a. 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1×108個(gè)/ml。必須指出，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作，Z好是滅活處理。 b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時(shí)，蒸餾水洗滌3次；加上述細(xì)菌懸液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時(shí)封閉。 c. 步驟b也可采用先每孔加50ul細(xì)菌懸液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃預(yù)冷的無水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時(shí)封閉。 d. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可在-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩? e. 以下步驟同上法。 D、 用全細(xì)胞抗原的ELISA a. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液。 b. 淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。 c. 每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5×104個(gè)；1500r/min 15分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鐘；可4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩? d. 以下步驟同上法。 E、抗體捕捉ELISA試驗(yàn) 本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下： a. 以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標(biāo)板，每孔加100ul，37℃ 2小時(shí)或4℃過夜。 b. 洗滌、拍干后加待測(cè)的McAb樣品，37℃ 1-2小時(shí)。 c. 洗滌后加適量的抗原，37℃ 1-2小時(shí)。 d. 洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，37℃ 1-2小時(shí)。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。

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