酶活性分析的常用方法

zhangchuanwen9 2016-12-01 09:27:20 477 瀏覽

生化

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爵栗 2016-12-01 19:59:13

　　一、量氣法　　在封閉的反應(yīng)系統(tǒng)中如有氣體變化，通過測量變化后的氣體體積或壓力很容易計(jì)算出氣體變化量，這是量氣法的基本原理。曾在檢驗(yàn)科廣泛應(yīng)用的Van-slyke測二氧化碳結(jié)合力的方法就是量氣法的一個(gè)典型例子。Warburg進(jìn)一步加以發(fā)展，設(shè)計(jì)出專用于測定酶活性的華勃呼吸儀。這種儀器特別適用于測定那些在反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗氣體的酶，例如氧化酶反應(yīng)涉及到O2的消耗，脫羧酶會(huì)產(chǎn)生CO2。但也不于這些酶，科學(xué)家采用與CO2氣體保持平衡過的重碳酸鹽體系，可用來測定各種產(chǎn)生H+的酶反應(yīng)，如各種還原酶，可使NADH變?yōu)镹AD和H+，而H+會(huì)促使反應(yīng)體系中重碳酸鹽變?yōu)镃O2氣體。　　二、比色法與分光光度法　　在20世紀(jì)上半個(gè)世紀(jì)華勃儀得到研究實(shí)驗(yàn)室廣泛的應(yīng)用，并在酶學(xué)上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術(shù)要求高而且靈敏度低。臨床常規(guī)中很少使用。多使用簡單易行的比色法測酶活性。在上半個(gè)世紀(jì)建立了一些適用于常規(guī)工作的測酶活性濃度的方法，如測定淀粉酶的Somogyi法，堿性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時(shí)間后停止酶反應(yīng)，加入各種化學(xué)試劑與產(chǎn)物或基質(zhì)反應(yīng)呈色，用比色計(jì)在可見光處比色，同時(shí)將被測物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較后計(jì)算出在此段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物消耗量，從而求得反應(yīng)速率v。　　比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因?yàn)榉止夤舛确ㄓ幸韵聨讉€(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：一是測定范圍不只局限在可見光，還可擴(kuò)展到紫外和紅外部分。這就為擴(kuò)大測定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應(yīng)就可直接測定產(chǎn)物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應(yīng)A－＞B＋C，A、B、C三種物質(zhì)用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。　　圖17-1 A、B、C三種物質(zhì)的吸收曲線　　可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無吸光度變化因此無需停止酶反應(yīng)，只要在560nm處測定吸光度變化就很容易計(jì)算出C的變化速度，而且C物質(zhì)比A、B二物質(zhì)有更高的吸收峰，即靈敏度Z高。　　這類方法中Z成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無吸光性。因此建立了一類和原來比色法截然不同方法。不需停止酶反應(yīng)，在340nm根據(jù)吸光度變化，就可觀察到酶反應(yīng)變化全過程。　　第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不需要如比色法那樣，作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，因?yàn)榉止夤舛扔?jì)使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質(zhì)的吸光度為常數(shù)，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據(jù)此值從吸光度△A/△T不難計(jì)算出酶催化反應(yīng)速度v。　　分光光度計(jì)的這些簡便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)使它在近年來已逐步取代比色法而成為目前Z流行的方法。其缺點(diǎn)是需要精確帶恒溫裝置的分光光度計(jì)，在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)尚難推廣。　　分光光度法的技術(shù)多樣化。設(shè)計(jì)得當(dāng)可用于各種酶的測定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化還原物質(zhì)特性。　　除了前述的NAD(P)H系統(tǒng)可用于脫氫酶測定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來測定各種含這二個(gè)輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強(qiáng)吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細(xì)胞色素還原型在可見光有一個(gè)非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質(zhì)主要用于氧化還原酶的測定。　　科學(xué)家還設(shè)計(jì)出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法測定。例如合成了很多對硝基酚的衍生物，用于各種水解酶的測定。堿性磷酸酶底物磷酸對硝基酚就是一個(gè)成功例子。又如測芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對硝基酚為底物，其分解產(chǎn)物的吸收峰由原來的278nm變?yōu)?18nm，Webb成功地在330nm進(jìn)行此酶監(jiān)測　　表17-2 一些氧化還原物質(zhì)的特性　　物質(zhì) 波長（nm）克分子吸光度　　還原型氧化型　　NAD，NADP 340 6300 0 　　FMN 450 12200 　　FAD 450 11300 　　細(xì)胞色素C 550 29500 8300 　　亞甲藍(lán)（等消光點(diǎn)） 610 0 41000 　　二氫酚吲哚酚 600 0 21000 　　吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000 　　抗壞血酸 265 15100 　　連二亞硫酸鹽 314 8000 0 　　氰化鐵（亞鐵） 420 0 1020 　　分光光度法的上述原理還可以用于其它酶的測定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不飽和鍵，在330nm處有很強(qiáng)吸收峰，而酶作用產(chǎn)物無此不飽和鍵。則不難在330nm處對這些酶進(jìn)行直接測定。　　此后在分光光度法的發(fā)展過程中又導(dǎo)入了酶偶聯(lián)技術(shù)。使得分光光度法幾乎能測定所有的酶。因此臨床實(shí)驗(yàn)室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術(shù)，不了解各種影響因素，要作好酶的測定是很困難的。　　三、熒光法和同位素法　　分光光度法有一個(gè)缺點(diǎn)，即靈敏度較低。有些標(biāo)本中酶濃度很低時(shí)往往測不出來。此時(shí)可考慮改用熒光法，可將測定靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。如科學(xué)家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由于水解產(chǎn)物甲基傘形酮有強(qiáng)烈熒光，大大提高測定的靈敏度，就是分光光度法中Z常用的NAD(P)H反應(yīng)系統(tǒng)，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發(fā)下NAD(P)H產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，而NAD(P)不被激發(fā)。此外，還可使用在熒光法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的時(shí)間分辨熒光法，例如北京醫(yī)院就曾利用此種靈敏度極高方法測定很難用其它方法檢測的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產(chǎn)生非特異熒光干擾測定，或者引起熒光的淬滅使測定不準(zhǔn)，故此種方法多用于研究實(shí)驗(yàn)室，少用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。為提高靈敏度，還可使用同位素標(biāo)記的底物進(jìn)行酶測定，例如，有人以C12標(biāo)記的乙酰膽堿為底物測定膽堿酯酶，在酶作用后以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由于對人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。　　四、其它方法　　離子選擇電極法，旋光法等有時(shí)用于測定特定的酶，當(dāng)酶反應(yīng)牽涉到有酸堿變化時(shí)，很容易用pH儀直接觀察酶反應(yīng)過程中H+的變化。直接用pH儀測酶反應(yīng)有兩個(gè)缺點(diǎn)：一是隨pH變化，會(huì)偏離酶作用的Z適pH值，不可避免地引起酶反應(yīng)速度變慢。其二是如測定的標(biāo)本不是純酶時(shí)標(biāo)本中其他蛋白及其它有緩衡能力的物質(zhì)將會(huì)影響所測pH變化的程度。此時(shí)如改用電位滴定儀則更為適合。此儀器可在酶反應(yīng)過程中不斷向反應(yīng)體系中加入酸或堿以維持反應(yīng)體系pH的恒定，而加入的酸堿量只與體系中H+變化量相關(guān)，和反應(yīng)體系中緩衡能力無關(guān)。　　同樣如酶反應(yīng)中有O2變化，可使用氧電極來監(jiān)測酶反應(yīng)過程，這可用來測定葡萄糖氧化酶活性，Chappell還成功地將此技術(shù)用于測線粒體的氧化能力。還曾有人嘗SY二氧化碳和氨電極測酶，由于這些電極反應(yīng)時(shí)間較慢，不利于檢測酶反應(yīng)速度。有些酶的反應(yīng)物為光學(xué)異構(gòu)體，則可根據(jù)旋光度變化來追蹤酶反應(yīng)。某些反應(yīng)物如羥基酸本身雖無旋光性，但與鉬結(jié)合后產(chǎn)生很高的旋光性。根據(jù)此特性建立了測定延胡索酸水合酶的方法。還有個(gè)別酶的測定使用了極譜法、GX液相色譜法等?？傊?，實(shí)驗(yàn)室工作者完全可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和技術(shù)，創(chuàng)造性地建立一些新的測活性濃度的方法。

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常用失效分析方法

多種試驗(yàn)技術(shù)可以用來幫助失效分析師確定失效原因。失效分析師根據(jù)專業(yè)知識(shí)，聯(lián)合運(yùn)用各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析斷裂源處的失效起因、材料異常、操作損害。為避免爭論，通常有必要使用現(xiàn)代試驗(yàn)工具，尋找支持簡單試驗(yàn)得出結(jié)果的進(jìn)一步的證據(jù)。失效分析師的才能在于選擇正確類型的測試和檢查，開展這些測試和檢查的順序也很重要。

1、視覺檢查

視覺檢查是失效分析的diyi步，也是很重要的一步。有經(jīng)驗(yàn)的人員憑借肉眼仔細(xì)檢查失效零部件的缺陷可以得到大量信息。可能通過研究斷口表面shou選大概確定失效類型（塑性、脆性、疲勞等等），也有可能通過研究斷口形貌定位裂紋起源位置。

檢查斷口起源和縱剖面組織會(huì)提供引起裂紋萌生的異?；驌p傷的線索，常用體視顯微鏡和放大鏡協(xié)助肉眼尋找細(xì)節(jié)線索。

2、無損檢測

對失效部件進(jìn)行無損檢測，并結(jié)合未使用的部件的檢測結(jié)果，可以提供缺陷類型信息、從部件生產(chǎn)階段上遺留下來的缺陷和服役期間缺陷的產(chǎn)生。滲透檢測、射線檢測、超聲檢測是提供這些信息的有效技術(shù)。無損檢測的目的是分析一些跡象，并且區(qū)分主要缺陷與二次損傷。若需要，殘余應(yīng)力測量也會(huì)給出有用的信息。

3、斷口分析

掃描電子顯微鏡（SEM），由于具有大的景深和分辨率，因此是失效分析的重要工具并且被譽(yù)為失效分析師的眼睛。通過SME進(jìn)行斷口檢查，失效模式、裂紋起源、引起失效的異常等等可以準(zhǔn)確定義。在部件自由表面產(chǎn)生的缺陷，由于SEM具有高的景深，裂紋起源處和斷裂特征可以同時(shí)檢查以確定損傷類型和裂紋萌生處的異常。

4、顯微分析

能譜分析設(shè)備，作為所有現(xiàn)代SEM可用的附件，可以用來分析失效件的材料成分，以確定可能在起源處出現(xiàn)的雜質(zhì)、渣坑、腐蝕產(chǎn)物、外來沉積等物質(zhì)的組成元素。在粗糙表面產(chǎn)生的分析信息應(yīng)小心使用，根據(jù)EDS產(chǎn)生的成分信息的分析特點(diǎn)，如波譜分析（WDS）的互補(bǔ)技術(shù)可以用來分析EDS能譜中能級(jí)重合的元素，如含鉬合金中的硫。電子探針（EPMA）是定量分析微觀結(jié)構(gòu)特征的極有用的技術(shù)。電子探針產(chǎn)生的感興趣位置的X射線圖像，如渣坑、腐蝕產(chǎn)物、氧化物等等，為定義感興趣特征區(qū)域的源或機(jī)理的信息。俄歇電子譜（AES）是一項(xiàng)極好的技術(shù)，用于原位定義斷口試樣上的脆性特征。由磷、錫、砷、銻在原奧氏體晶界偏析引起的回火脆性和由硫在原奧氏體晶界處析出的脆性硫化物，是非常多可以用AES明顯識(shí)別的情況中的兩種。

5、化學(xué)分析

在材料成分與規(guī)定有一定程度偏差是主要失效原因的情況下，有必要精確確定失效組分的組成。有很多基于原子吸收和發(fā)射原理的分析方法都可以用于元素含量的估測，在含量為百分之幾十至十億分之幾的范圍內(nèi)。

X射線熒光譜分析方法（XRF）用于工廠分析而控制熔體成分和原材料分析，因?yàn)檫@種方法容易同時(shí)分析一個(gè)固體樣品上的大量元素。原子吸收光譜和它的現(xiàn)代變種廣泛用于精確測試，特別是對于痕量元素的分析。氫、氧、氮通過真空和惰性氣體熔融技術(shù)，碳和硫通過燃燒方法。

6、微觀組織檢測

失效件的微觀組織提供了有價(jià)值的信息。眾所周知微觀組織決定了力學(xué)性能以及金屬材料的斷裂行為，這又與成分、熱處理過程相關(guān)。通過仔細(xì)研究微觀結(jié)構(gòu)，可能找到成分設(shè)計(jì)、工藝、熱處理的缺點(diǎn)。微觀結(jié)構(gòu)損害在很多情況下不是非常明顯，因此一個(gè)失效分析師必須受訓(xùn)以確定他們。晶界薄膜和孔洞、不合適的第二相分布、脆性相的存在、表面損傷（由氧化、腐蝕、磨損和侵蝕）、非金屬夾雜、縮孔等等，是可以較容易通過金相檢查確定的缺陷中的一些。有時(shí)，可能有必要通過一些材料特定的測試，尋找所觀察到不正常微觀組織的支持和確定性的證據(jù)。失效分析過程中產(chǎn)生的一些情況，光學(xué)顯微鏡的分辨率和放大倍數(shù)不適合檢查特別細(xì)小的微觀組織細(xì)節(jié)。例如，殘余奧氏體在板條邊界處轉(zhuǎn)化為碳化物引起時(shí)效馬氏體脆性，或鎳基高溫合金渦輪葉片析出的γ′相在高的工作溫度暴露，這些情況的學(xué)習(xí)有必要使用高分辨率技術(shù)例如透射電子顯微鏡（TEM）。SEM也可以用于研究細(xì)小的微觀組織特征，當(dāng)感興趣區(qū)域的對比度可以通過背散射電子圖像獲取或者深腐蝕技術(shù)。

7、機(jī)械測試

盡管機(jī)械測試很少被當(dāng)做失效分析過程中的一個(gè)需求，但特定的測試仍是有必要的，它可以用于產(chǎn)生支持案例失效分析的一些數(shù)據(jù)。硬度測量，操作簡單并且對制樣要求Z低，可以提供因微觀結(jié)構(gòu)變化引起的性能變化的信息。感興趣的微觀結(jié)構(gòu)特征處測量微觀硬度對于失效分析是及其有用的。

8、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和解釋

失效分析的Z關(guān)鍵步驟是對使用各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的解釋。有必要(a)列出產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)，(b)基于科學(xué)原則分析數(shù)據(jù)，(c)在證據(jù)或確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上消除貌似矛盾的原因，(d)考慮斷裂模式的所有可能原因，(e)Z終確認(rèn)Z可能的失效原因。一旦確認(rèn)了失效原因，特定的補(bǔ)救方法也就比較明顯，Z合理的補(bǔ)救方法應(yīng)被設(shè)計(jì)者、制造者和用戶采用。

2020-04-30 14:11:21 608 0