天津本生詳述PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用

　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

　　1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。

　　2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

　　二、實(shí)驗(yàn)原理

　　PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

　　PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。

　　PCR由變性－－退火－－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;

　?、谀０錎NA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;

　?、垡锏难由欤篋NA模板－－引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

　　重復(fù)循環(huán)變性－－退火－－延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

　　三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材

　　模板DNA、2.5mmol/LdNTP

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O

　　PCR儀、移液槍、PCR板

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA2μL

　　引物11μL

　　引物21μL

　　dNTP1.5μL

　　MgCl22μL

　　10×buffer2μL

　　ddH2O10μL

　　Taq酶0.5μL

　　2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。

　　3、上樣，啟動(dòng)反應(yīng)程序。

　　4、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。

　　PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用!先和大介紹到這，如果想要了解更多PCR的信息，可以關(guān)注天津本生生物，專業(yè)給生物醫(yī)藥客戶提供生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)耗材，歡迎廣大客戶來詢。

PCR（polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶鏈反應(yīng)，是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴(kuò)增至足夠數(shù)量，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析。PCR應(yīng)用場(chǎng)景廣泛，不僅在基礎(chǔ)研究方面，還包括醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等各大領(lǐng)域。

近期多篇醫(yī)學(xué)研究多篇文獻(xiàn)中均應(yīng)用到PCR技術(shù)及PCR儀產(chǎn)品，小編為大家做一下簡(jiǎn)要分享。

近期南方醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)博士生導(dǎo)師、主任醫(yī)師王雅棣課題組在醫(yī)學(xué)期刊《Oncology Research and Treatment》上發(fā)表題為Preliminary Clinical Validation of a Filtration-Based CTC Assay for Tumor Burden and HER2 Status Monitoring in Metastatic Breast Cancer的文章，探索研究基于過濾的CTC測(cè)定轉(zhuǎn)移性乳腺癌腫瘤負(fù)荷和HER2狀態(tài)監(jiān)測(cè)的初步臨床驗(yàn)證情況。

背景介紹：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，大部分CTC在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。CTC檢測(cè)通過捕捉檢測(cè)外周血中痕量存在的CTC，監(jiān)測(cè)CTC類型和數(shù)量變化的趨勢(shì)，以便實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)、評(píng)估治療效果，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)個(gè)體治療。循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC) 承載著從基因組改變到蛋白質(zhì)組構(gòu)成的多維腫瘤相關(guān)信息，是一種很有前途的液體活檢材料。 CTC 的臨床有效性在轉(zhuǎn)移性乳腺癌 (MBC) 中得到了最廣泛的研究。  CELLSEARCH?檢測(cè)是目前使用最廣泛的方法，研究者們同時(shí)也在尋求替代策略。一種基于過濾的微流體裝置已被用于富集 CTC，但其臨床相關(guān)性仍然未知。

方法：在這項(xiàng)初步研究中，作者研究團(tuán)隊(duì)招募了 47 名 MBC 患者，并評(píng)估了上述 CTC 檢測(cè)在腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)和人表皮生長(zhǎng)因子受體 2 (HER2) 狀態(tài)測(cè)定方面的性能。結(jié)果：在基線時(shí)，51.1% 的患者 (24/47) 為 CTC 陽(yáng)性。在伴隨著較差的放射學(xué)反應(yīng)評(píng)估的樣本中，CTC 計(jì)數(shù)和陽(yáng)性率也顯著升高。連續(xù)抽血表明，與血清標(biāo)志物癌胚抗原和癌抗原 15-3 相比，CTC 計(jì)數(shù)能夠更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。此外，與之前的報(bào)告相比，CTC-HER2 狀態(tài)與腫瘤-HER2 狀態(tài)中度一致。選定樣本中的 HER2 拷貝數(shù)測(cè)量進(jìn)一步支持了 CTC-HER2 狀態(tài)評(píng)估。

結(jié)論：這項(xiàng)研究的初步結(jié)果表明，CDC 檢測(cè)在幾個(gè)方面都有希望，包括敏感的 CTC 檢測(cè)、準(zhǔn)確的疾病狀態(tài)反映和 HER2 狀態(tài)確定。目前需要更多的研究來驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步表征CTC測(cè)定的價(jià)值。

在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，柏恒科技RePure-A 梯度PCR儀發(fā)揮了一定作用，助力作者實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行。

而在另一篇發(fā)表在《Frontiers in Molecular Biosciences》期刊上的論文，柏恒科技PCR儀也發(fā)揮了不小作用。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院腎內(nèi)科主任醫(yī)師、博士生及碩士生導(dǎo)師李冰課題組發(fā)表的題為Bioinformatic Analysis Combined With Experimental Validation Reveals Novel Hub Genes and Pathways Associated With Focal Segmental Glomerulosclerosis的文章，作者研究團(tuán)隊(duì)利用生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，揭示了與局灶性節(jié)段性腎小球硬化相關(guān)的新型Hub基因和通路。

 背景介紹：局灶節(jié)段性腎小球硬化癥 (focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)是一種臨床病理綜合征，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿或腎病綜合征，病理以局灶節(jié)段分布的腎小球硬化病變及足細(xì)胞變性所致足突融合或消失為特征，多數(shù)表現(xiàn)為激素治療抵抗，并進(jìn)行性發(fā)展至終末期腎病 (ESRD)。本研究旨在探索與FSGS相關(guān)的樞紐基因和通路，以確定潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。

方法：作者團(tuán)隊(duì)從 Gene Expression Omnibus (GEO) 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了微陣列數(shù)據(jù)集 GSE121233 和 GSE129973。數(shù)據(jù)集包括 25 個(gè) FSGS 樣本和 25 個(gè)正常樣本。使用R包“l(fā)imma”識(shí)別差異表達(dá)基因（DEG）。Gene Ontology (GO)功能和（KEGG）通路富集分析使用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，可視化和集成發(fā)現(xiàn) (DAVID)，用于識(shí)別 DEG 的通路和功能注釋。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）是基于檢索相互作用基因（STRING）數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索工具構(gòu)建的，并使用 Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化。然后使用 Cytoscape 的 cytoHubba 插件評(píng)估 DEG 的中心基因。使用 FSGS 大鼠模型通過定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) (qRT-PCR) 驗(yàn)證中shu基因的表達(dá)，并進(jìn)行接受者操作特征 (ROC) 曲線分析以驗(yàn)證這些中(shu)樞基因的準(zhǔn)確性。

結(jié)果：在兩個(gè) GSE 數(shù)據(jù)集（GSE121233 和 GSE129973）中共識(shí)別出 45 個(gè) DEG，包括 18 個(gè)上調(diào)和 27 個(gè)下調(diào)的 DEG。其中，選擇了5個(gè)具有高度連通性的樞紐基因。在 PPI 網(wǎng)絡(luò)中，前 5 個(gè)中(shu)樞基因中，F(xiàn)N1 上調(diào)，而 ALB、EGF、TTR 和 KNG1 下調(diào)。 FSGS大鼠的qRT-PCR分析證實(shí)FN1的表達(dá)上調(diào)，EGF和TTR的表達(dá)下調(diào)。 ROC 分析表明 FN1、EGF 和 TTR 對(duì) FSGS 顯示出相當(dāng)大的診斷效率。

結(jié)論：通過生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鑒定出三個(gè)新的 FSGS 特異性基因，這可能會(huì)促進(jìn)對(duì) FSGS 的分子基礎(chǔ)的理解，并為臨床管理提供潛在的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用了柏恒科技熒光定量PCR儀進(jìn)行樣品測(cè)定并分析。

除了以上列出的幾篇文獻(xiàn)，柏恒科技PCR儀在生物科研、動(dòng)物疫病等方面均有廣泛應(yīng)用，下期我們?cè)倮^續(xù)分享。

文獻(xiàn)中PCR儀產(chǎn)品簡(jiǎn)介

RePure系列智能二維梯度PCR儀

本系列PCR儀具有二維梯度摸索功能，多種梯度摸索模式；

自適應(yīng)壓桿式熱蓋，合蓋緊蓋一步到位；

前進(jìn)后出式風(fēng)道，機(jī)器可并排放置，節(jié)約實(shí)驗(yàn)空間；

Q3200系列熒光定量PCR儀

本系列熒光PCR儀采用四通道雙16孔模塊設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用；

最大升降溫速率8℃/s，大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間；

體積小，重量輕，方便攜帶；

更多PCR儀技術(shù)應(yīng)用，歡迎關(guān)注柏恒科技，我們提供各類梯度PCR儀、熒光PCR儀等，并為客戶提供生物學(xué)相關(guān)檢測(cè)解決方案。

薄膜蒸發(fā)器是通過旋轉(zhuǎn)刮膜器強(qiáng)制成膜，并高速流動(dòng)，熱傳遞效率高，停留時(shí)間短，可在真空條件下進(jìn)行降膜蒸發(fā)的一種新型蒸發(fā)器。是一種蒸發(fā)器的類型，特點(diǎn)是物料液體沿加熱管壁呈膜狀流動(dòng)而進(jìn)行傳熱和蒸發(fā)，優(yōu)點(diǎn)是傳熱效率高，蒸發(fā)速度快，物料停留時(shí)間短，因此特別適合熱敏性物質(zhì)的蒸發(fā)。 

機(jī)組由蒸發(fā)器、汽液分離器、預(yù)熱器三個(gè)部件和一只簡(jiǎn)易分離器組成，蒸發(fā)器為升膜式列管換熱器。該蒸發(fā)器具有生產(chǎn)能力大、效率高、物料受熱時(shí)間短等特點(diǎn)。

適用于制藥、食品、化工等行業(yè)的稀溶液濃縮，本設(shè)備與物料接觸部分均采用不銹鋼制造，具有良好的耐腐蝕性能，經(jīng)久耐用，符合藥品衛(wèi)生要求。 在熱交換工程中，刮板式薄膜蒸發(fā)器得到廣乏的應(yīng)用。尤其對(duì)熱敏性物料（時(shí)間短暫）的熱交換，刮膜器有利于熱交換的進(jìn)行，并通過不同的刮膜器設(shè)計(jì)，能進(jìn)行復(fù)雜產(chǎn)品的蒸餾。

什么是造影劑

      核磁共振成像（MRI)目前普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)成像中，具有無輻射損傷的安全性，可任意方位斷層掃描等技術(shù)靈活性，加以涵蓋質(zhì)子密度、弛豫、加權(quán)成像以及多參數(shù)特征的優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)代臨床診斷中Z有力的檢測(cè)手段之一，然而臨床發(fā)現(xiàn)某些不同組織或腫瘤組織的弛豫時(shí)間相互重疊,導(dǎo)致診斷困難。因此人們開始研究造影劑，增強(qiáng)信號(hào)對(duì)比度、提高圖像分辨率。其作用主要是通過注射造影劑來改變組織局部弛豫特性，提高成像對(duì)比度，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。

      造影劑是一類化學(xué)合成的其密度高于活體組織的物質(zhì)，造影劑本身不產(chǎn)生信號(hào)，通過改變體內(nèi)局部組織中水質(zhì)子的弛豫效率，與周圍組織形 成對(duì)比，從而達(dá)到造影目的。

造影劑的原理

      帶有磁性的物質(zhì)如Fe、Mn、Gd等，具有多個(gè)不成對(duì)的電子，當(dāng)這些物質(zhì)接近共振中的氫原子時(shí)，能有效地改變質(zhì)子所處的磁場(chǎng)，造成T1和T2弛豫時(shí)間明顯縮短。造影劑能改變體內(nèi)局部組織中水質(zhì)子的弛豫速率，提高正常與患病部位的成像對(duì)比度和分辨率，為病變定位和診斷提供更多的信息（圖1和圖2所示）。

      MRI造影劑又為順磁性或超順磁性物質(zhì)，能同氫核發(fā)生磁性的相互作用，他們進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，將引起縱向弛豫速率（1/T1)和橫向弛豫速率（1/T2)的改變，在順磁物質(zhì)的作用下，其抗磁和順磁貢獻(xiàn)具有加和性，即：

(1/Ti)觀察=(1/Ti)抗磁+(1/Ti)順磁 , (其中i=1,2)

在不存在溶質(zhì)之間相互作用的情況下，溶劑的弛豫速率與所加的順磁物質(zhì)的濃度（mol/L)成線性關(guān)系，即：

(1/Ti)觀測(cè)=(1/Ti)抗磁+求和ri[C] , (其中i=1,2)

其中ri為順磁物質(zhì)的弛豫效率（Relaxivity，單位mmol/L·s），求和是針對(duì)溶液中造影劑的種類而言，T1類型造影劑，如Gd類配合物，成像時(shí)相關(guān)部位變亮，又稱為陽(yáng)性造影劑；T2類型造影劑，如基于Fe3O4離子的超順磁性造影劑，成像時(shí)相關(guān)部位變暗，又稱為陰性造影劑。

造影劑的應(yīng)用：

弛豫效率是MRI造影劑關(guān)鍵指標(biāo)之一。弛豫效率高的樣品，可以使用Z少的量達(dá)到Z好的效果；在造影劑研究領(lǐng)域，紐邁專門開發(fā)了小型的核磁共振成像分析儀，可測(cè)試方便的測(cè)試造影劑T1、T2弛豫時(shí)間，并可對(duì)試管樣品進(jìn)行成像，提供定量和定性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，為造影劑產(chǎn)品的研發(fā)與改進(jìn)提供快速可靠的檢測(cè)手段。

造影劑在體內(nèi)的作用評(píng)價(jià)：

造影劑在腎臟中的代謝過程監(jiān)測(cè)，該造影劑在小鼠體內(nèi)腎臟部位代謝時(shí)間超過250min,且作用頂峰時(shí)間約在注入后130min。 

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，低場(chǎng)核磁共振可為您提供以下科研方案

1)造影劑研究：弛豫率 效能評(píng)價(jià) 體內(nèi)代謝評(píng)價(jià)；

2)體表腫瘤研究：造影材料作用 藥物靶向 腫瘤藥效評(píng)估;

3)原位腫瘤研究：位置排查 轉(zhuǎn)移判斷 尺寸測(cè)試；

4)清醒動(dòng)物體成分分析：瘦肉 脂肪 自由水含量 脂肪分布；

（來源：蘇州紐邁分析儀器股份有限公司）

上次我們介紹了單顆粒ICP-MS 的原理，可以高分辨的檢測(cè)到每個(gè)小至納米尺寸的顆粒中的元素類型，顆粒尺寸，并可以統(tǒng)計(jì)樣品中納米顆粒的粒徑分布。每個(gè)納米顆粒產(chǎn)生一個(gè)脈沖峰，所得信號(hào)的強(qiáng)度同顆粒尺寸相關(guān)，脈沖數(shù)與顆粒濃度相關(guān)。這種技術(shù)基于超快速掃描時(shí)間的四級(jí)桿質(zhì)量分析器，目前已經(jīng)可以達(dá)到10μs 的采樣時(shí)間，1 秒鐘就能采集多達(dá)100000 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

利用單顆粒ICP-MS的快速采樣時(shí)間的技術(shù)，搭配專用的進(jìn)樣系統(tǒng)，就可以分析每個(gè)細(xì)胞中的金屬含量，稱為單細(xì)胞ICP-MS。細(xì)胞逐個(gè)進(jìn)入等離子體，被電離，內(nèi)部金屬產(chǎn)生的離子云被ICP-MS 檢測(cè)。在單細(xì)胞ICP-MS 分析中，每個(gè)細(xì)胞被看做是一個(gè)單獨(dú)的個(gè)體或粒子，可以產(chǎn)生自己的離子云。

準(zhǔn)確地定量單個(gè)細(xì)胞的金屬含量，可以更好的理解單個(gè)細(xì)胞對(duì)金屬和/或含金屬納米顆粒的吸收和清除機(jī)制，含金屬藥物與細(xì)胞相互作用的機(jī)制，以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞群中的分布。傳統(tǒng)的測(cè)量細(xì)胞中金屬含量的方法使用名義質(zhì)量濃度，即假設(shè)金屬在細(xì)胞間的分布是相等的，從而忽略了在單細(xì)胞水平上金屬分布和變化的重要信息。

使用單細(xì)胞ICP-MS，我們可以獲得以下信息

每個(gè)細(xì)胞的金屬含量

細(xì)胞群的金屬含量分布

含有金屬或納米顆粒的細(xì)胞濃度

每個(gè)細(xì)胞的納米顆粒數(shù)量

將納米顆粒設(shè)計(jì)為同時(shí)攜帶藥物和成像探針的模式，以便同時(shí)檢測(cè)和ZL癌癥。還可將其設(shè)計(jì)為專門針對(duì)機(jī)體病變組織和細(xì)胞的模式。納米顆粒相對(duì)傳統(tǒng)小分子藥物，具備以下優(yōu)勢(shì)（i）延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；（ii）減少非特異性細(xì)胞攝取、意外偏離目標(biāo)和副作用；以及（iii）通過特定癌細(xì)胞靶向部分來提高細(xì)胞相互作用。很多基于納米粒子的癌癥療法已獲準(zhǔn)在臨床上使用和/ 或目前正在開發(fā)中。

金納米顆粒AuNP

制備檸檬酸鹽穩(wěn)定劑的50 nmAuNP，并聚乙二醇化。

癌細(xì)胞

人類T24 膀胱癌細(xì)胞。在組織培養(yǎng)處理過的培養(yǎng)皿上采用McCoy 培養(yǎng)基（補(bǔ)充10% FBS），將細(xì)胞培養(yǎng)為單層細(xì)胞。

攝入實(shí)驗(yàn)

以每孔一百萬個(gè)細(xì)胞的密度接種T24 癌細(xì)胞，并在37 ℃（5% CO2）的溫度下培養(yǎng)24 小時(shí)，以確保細(xì)胞粘附在培養(yǎng)皿表面。然后，在濃度為0.4nM AuNP 的McCoy 培養(yǎng)基（補(bǔ)充10% FBS）中，讓細(xì)胞和50 nm聚乙二醇化的AuNP 接觸4 小時(shí)。形成Z終濃度為100,000 個(gè)細(xì)胞/mL 的單細(xì)胞懸浮液。

結(jié)論

結(jié)果表明，每個(gè)細(xì)胞吸收的AuNP 分布并不均勻，特定細(xì)胞群內(nèi)的某些細(xì)胞比其他細(xì)胞明顯攝取更多AuNP。SC-ICP-MS 是一個(gè)強(qiáng)大的分析工具，可在單個(gè)細(xì)胞水平上量化元素濃度和納米粒子的分布。這項(xiàng)技術(shù)在單細(xì)胞基礎(chǔ)上，具有提供的納米粒子-細(xì)胞相互作用差異新見解的潛力。

掃描二維碼，即可下載珀金埃爾默使用單細(xì)胞ICP-MS 法定量癌癥細(xì)胞對(duì)金納米粒子的攝取率應(yīng)用報(bào)告。