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  陌傺燒贛牌用腹 2013-07-24 00:00:00

  伏曲酵母菌的分類鑒定及來源分析的研究 王世寬h2，潘明“‘，侯華‘，張強(qiáng)h。，于海先1 (1．四川理T學(xué)院爭物工程學(xué)院，四川自貢643000；2．釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省ZD實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000) 摘要：目的：統(tǒng)計(jì)分析酵母菌的來源，為大曲微生物物種及其來源變化提供基礎(chǔ)資料。方法：利用Biolog微生物自動(dòng)分析系 統(tǒng)進(jìn)行精確鑒定，并通過統(tǒng)計(jì)分析得出微生物菌種的來源。結(jié)果：從伏曲樣品中分離純化出7株酵母菌J—l，2，3，4，5，6，7，利用 Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，確定其分別為自吉利絲孢酵母A、無名假絲酵母菌、漢遜德巴利酵母c、海隱球酵母菌、東 方伊薩酵母菌、解脂耶羅威亞酵母菌、皺落假絲酵母菌。這些物種主要來源于原料本身和空氣，原料為了人室大曲提供了J—l， 2，3三種酵母菌，其比例為25．45％、19．23％和7．5％。結(jié)論：空氣巾含有大曲中所有的酵母菌的種類，曲房空氣中的酵母菌數(shù)量 和種類均較多。 關(guān)鍵詞：伏曲；酵母菌；分類鑒定；來源 中圖分類號(hào)：Q939．II+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-311x(20lo)02-0037—09 Study of Classification and Identification to Yeast Strains and the Source WANG Shi—kuank。，PAN ruin91”，HOU Hual。ZHANG Qian91”，YU Hai—guan91， (1．Bioengineering Deptutment of Sichuan University of Science and Engineering。Zigong 643000，China； 2．Liquor Marking Biological Technology and Application of Key Laboratory of Siehuan Province，Zigong 643000，China) Abstract：Objective：The SOUlice$of yeast were abtained by statistic and analysis．which provided basic data of Duqu microorganism species and their goulrc虻s and changes．Method：Biolog automated microbes identification system(Biolog System)was used to identificated． and the sou批s of microorganism species were obtained by statistic and analysis．Result：Biolog automated microbes identification system (Biolog System)was used to check seven yeast stlains J—l，2，3，4，5，6，7，which wel'E separated and purified from fermented grains of summer Daqu．They were identified as Trichospor beigelii A；Candida無‘，，m缸，Cryptococcus marinus，Debaryomyces hansenii C，Issatchenkia orientalis，Yarrowia卻咖池，Candida rugom B．These species mainly come from raw material and air，law material provided J—l，2，3 three yeasts to Daqu，and which ratio were 25．45％，19．23％and 7．5％．Conclusion：Air contains all the types of Daqu yeast。the number and species of yeast were more in Qu—loom． Key words：Daqu：yeast；biolog automated microbes identlilcatioll system；source 四川瀘州地處潮濕的河谷地帶，溫度較高，濕度較大，有 利于微生物的生長繁殖，為優(yōu)質(zhì)的瀘州大曲提供了天然的生 態(tài)環(huán)境。大曲是微生物的大本營，也是酶的貯存庫，國外在我 國曲中分離出許多優(yōu)良菌種，文獻(xiàn)報(bào)到這些微生物主要是由 原料帶來的，原料上附著的微生物種類及數(shù)量，對(duì)大曲質(zhì)量起 到支配地位??。在大曲的制作和培養(yǎng)過程中，空氣所攜帶的 微生物也是大曲菌系重要來源之一。 眾所周知，酵母菌在原料淀粉質(zhì)的糖化、灑精的生成和香 氣物質(zhì)的形成等方面起著鶯要作用，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌 種群結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生變化，因此對(duì)大曲中酵母菌的種屬鑒定對(duì)自 收稿日期：2009—06—29；修回日期：2009—09一17 基金項(xiàng)目：Pq川省教育廳蓬大培育項(xiàng)日(07ZZ018)資助 作者簡介：王世寬(1964一)。男。教授．碩士。從事農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏與加工方 面的研究?！ねㄓ嵶髡撸河诤９?。Email：yuhaiguan9123@126．coul。 酒生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義。美國Biolog公司的Biolog微生物 自動(dòng)分析系統(tǒng)，可以鑒定包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)的近 2 000種微生物。Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)能利用計(jì)算機(jī)進(jìn) 行數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化程度高，鑒定范圍大、速度快，目 前已成為微生物分類鑒定常用的技術(shù)手段忙JJ。 本研究在利用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)精確鑒定的基 礎(chǔ)上，統(tǒng)計(jì)分析每種酵母菌來源的，為大曲微生物物種及其來 源變化提供基礎(chǔ)資料o l材料與方法 1．1材料 1．1．1實(shí)驗(yàn)材料 1．1．1．1樣品：樣品l：。久香”牌包包曲，由瀘州老窖生物工 程有限責(zé)任公司提供；樣品2：生產(chǎn)大曲的小麥原料；樣品3： 空氣(曲房、生產(chǎn)車間和廠區(qū))。 萬方數(shù)據(jù) 38 生物技術(shù) 1．1．1．2空氣樣品的采集：采樣時(shí)在曲廠外，分為4個(gè)方向， 每個(gè)方向布3個(gè)點(diǎn)，每隔500m布2個(gè)點(diǎn)，每個(gè)方向整體呈S 型隨機(jī)布點(diǎn)。廠區(qū)之內(nèi)隨機(jī)布點(diǎn)：制曲車間和曲房布點(diǎn)時(shí)采 取對(duì)角線布點(diǎn)，每條對(duì)角線取5點(diǎn)布皿。采用平皿落菌法：取 不同的培養(yǎng)基制成平板，在測定環(huán)境中選擇具有代表性的5 個(gè)點(diǎn)，揭開皿蓋，分別暴露于待測空氣中5min。 1．1．2培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基一J，BUY培養(yǎng)基(Biolog專用于 培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基)”j。 1．1．3儀器：Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)(美國Biolog公司)， 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。 1．2方法 1．2．1酵母菌的分離：平m稀釋法崢1和空氣沉降法。 1．2．2伏曲和原料菌懸液的制備 無菌條件下，取109伏曲和原料樣品，加入100mL無菌 水。充分搖勻，自然沉淀后取上清液，得到lO。1稀釋樣。然后 依次制成lO～～lO。稀釋樣。 1．2．3富集培養(yǎng) 從IO～一lO。菌種液中，各取0．5mL于含馬鈴薯液體培 養(yǎng)基的試管中，在28℃下恒溫培養(yǎng)48h后，根據(jù)菌種的生長狀 況，選取適當(dāng)?shù)脑嚬?，將其培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于另一管新鮮培養(yǎng)基 中，依照此法轉(zhuǎn)接2—3次，冉進(jìn)行分離。 1．2．4平板分離 將富集培養(yǎng)液作適當(dāng)稀釋，取0．5mL注入馬鈴薯培養(yǎng)基 瓊脂平皿上，用玻棒均勻涂布，于28"(3培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落特征 及鏡檢確認(rèn)為酵母菌后，挑取單菌落，平板劃線法純化，純菌 株移入斜面，備用。 1．2．5菌種鑒定：Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定”1。 2結(jié)果與分析 2．1 大曲培養(yǎng)過程中酵母茵的鑒定結(jié)果 Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果主要有3個(gè)參數(shù)，即可能性(Probabil． ity，PROB)、相似(Similarity，SIM)和位距(Distance，DIST)，其 中SIM值和DIST值是兩個(gè)蕈要參數(shù)，DIST值表示測試結(jié)果與 數(shù)據(jù)庫相應(yīng)數(shù)據(jù)條的位置，SIM值表示測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng) 數(shù)據(jù)條的相似程度。Biolog系統(tǒng)規(guī)定：酵母菌的SIM值在培養(yǎng) 24h時(shí)應(yīng)≥0．75，培養(yǎng)48h或72h時(shí)，SIM值>0．50，系統(tǒng)自動(dòng) 給出鑒定結(jié)果為種名。DIST值45．0，SIM值越接近1．00，表 明鑒定結(jié)果的可靠性越高。當(dāng)SIM值小于0．5，但鑒定結(jié)果中 屬名相同的結(jié)果的SIM值之和大于0．5時(shí)，自動(dòng)給出的鑒定 結(jié)果為屬名。酵母的鑒定結(jié)果見表l。 裹I Biolog系統(tǒng)對(duì)J一1，2。3。4。5，6。7的鑒定結(jié)果 Table I Identification result of Biolog System to J一1，2．3。4．5．6。7 由表l可以看出，J系列的酵母菌在系統(tǒng)下得到的3個(gè)參 數(shù)都比較理想，培養(yǎng)48h或72h時(shí)，SIM值均大于0．50，可能性 均在90％以上，與數(shù)據(jù)庫有一個(gè)良好的匹配，在ID地址欄顯 示出有一個(gè)Z佳的匹配名稱分別是Trichosporon beigelii A(白 吉利絲孢酵母A)、Candida扣，舭拋(無名假絲酵母)、Cryptocoecm marinus(漢遜德巴利酵母C)、Debaryomyces hansenii C(海 隱球酵母菌)、lt心atchenkia orientalis(東方伊薩酵母菌)、Yarrowia lipolytica(解脂耶羅威亞酵母菌)、Candida rugosa B(皺落假 絲酵母菌)。另外在名稱欄里還有10個(gè)名稱作為參考，它們 在排列空間上是與diyi菌種Z接近的9個(gè)菌種，文章只列出 Z佳匹配的菌種。 2．2整個(gè)發(fā)酵期酵母茵的分布情況 550 2010年20(2) l 3 5 7 9 20 40 時(shí)間∞ 圈I 發(fā)酵期酵母菌種類及數(shù)量的變化 Fig．1 Changes of yeast species and number on ferment stage 從圖l可以看出主要出現(xiàn)了5種酵母菌J—l，2，3，4，5， 分別白吉利絲孢酵母A、無名假絲酵母菌、漢遜德巴利酵母c、 海隱球酵母菌、東方伊薩酵母菌。J—l在發(fā)酵的9d里數(shù)量都 不是很多。并在第5d沒有出現(xiàn)；J一2，4，5在第3d達(dá)到Z大；J 一3在第5d達(dá)到了Z大值。J一6，7主要從堆積轉(zhuǎn)化期和儲(chǔ)存 期才開始出現(xiàn)的，數(shù)量不大，主要因?yàn)樵诙逊e轉(zhuǎn)化階段和儲(chǔ)存 階段大曲和空氣的接觸的時(shí)間很長，空氣中的一些酵母菌被 富集到了大曲的表面。 2．3小麥原料中酵母茵的分布情況 圈2小麥和入窒曲酵母菌數(shù)■的比較圈 Fig．2 Yeast number oDmpagison figure of wheat and the first day Daqu 從圖2可以看出小麥和入室曲中酵母菌數(shù)量的分布情 況．剛?cè)胧业那湍妇闹饕獊碓词切←溤媳旧?，主要有?種酵母菌J—l，2，3。分別占到25．45％、19．23％和7．5％。曲 坯上棲息大量野生微生物，代謝出各式各樣的酶系，在多種酶 的共同作用下生產(chǎn)出白酒有關(guān)的香氣。麩曲由于純種培養(yǎng)只 用一種霉菌，因?yàn)槊赶祮我唬燥L(fēng)味單調(diào)，這說明大曲釀制 白酒所產(chǎn)的香味，是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果。從數(shù)據(jù)上 看，原料上附著的微生物種類及數(shù)量都對(duì)大曲前期發(fā)酵有重 要的影響。有鑒于此，各企業(yè)應(yīng)制訂大曲原料標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格控制 曲原料質(zhì)量，其中原料附著微生物檢驗(yàn)尤為重要，對(duì)大曲里面 的微生物分析有指導(dǎo)性的意義。 2．4空氣中酵母茵的分布情況 從表2可以看出，曲房中的酵母菌主要有J一1，2，3，4，5， 大曲生產(chǎn)車間的酵母菌主要有J—l，2，3，4，5，7，廠區(qū)的酵母 菌的種類較多J一3，4，5，6，7，三地空氣中所檢測的曲房酵母 菌的數(shù)量Z多，可能是曲房的長期培養(yǎng)大曲，加上曲房的空氣 流動(dòng)性差，使其空氣中積累了大量的酵母。生產(chǎn)車間的酵母 菌的種類Z多。廠區(qū)空氣中J一6，7含量很大，為儲(chǔ)存期的酵 母菌提供了來源。從發(fā)酵過程來看，除了原料對(duì)大曲微生物 的來源影響很大，空氣也是一個(gè)很主要的影響因素，堆積轉(zhuǎn)化 期和儲(chǔ)存期所檢測到的微牛物就來自空氣。因?yàn)椴煌０胃?度的空氣，其微生物種群和數(shù)量不同．所以對(duì)曲房周嗣的空氣 長期檢測，形成一種特有的微生物環(huán)境，使曲房周圍的微生物 種類趨于穩(wěn)定，可使大曲中微生物菌系的形成趨于穩(wěn)定，對(duì)大 ∞ ∞ 卯 卯 ∞ 卯 4 3 2 1 ． 一曩∞專畜。flk已凝耱粗 萬方數(shù)據(jù) 2010年20(2) 曲的質(zhì)Z保證提供保證。 表2 空氣酵母菌檢測情況及數(shù)量表 Table 2 Yeast．umber table in air 生物技術(shù) 菌種—面?巡攀署咝監(jiān)礦 注：空氣細(xì)菌菌落總數(shù)(cfu／m’)=50 000N／AT，A代表甲板面積 (cr02)，T代表平板暴囂時(shí)同(rain)，N代表平均菌落數(shù)(era／平板)。 3討論 經(jīng)過Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)成功地鑒定出J一1，2， 3，4，5，6，7七株酵母蕭，分別為自吉利絲孢酵母A、無名假絲 酵母菌、漢遜德巴利酵母C、海隱球酵母菌、東方伊薩酵母菌、 解脂耶羅威亞酵母菌、皺落假幺幺酵母菌。說明該系統(tǒng)町用于 大曲微生物鑒定，其鑒定速度快，操作簡單，準(zhǔn)確性高。從鑒 定結(jié)果看，存在部分結(jié)果的PROB不高的現(xiàn)象，在排除純化不 好、培養(yǎng)時(shí)間過長或過短、污染、菌細(xì)胞太老、培養(yǎng)基錯(cuò)誤、接 39 種液濁度凋整不適、培養(yǎng)溫度有誤的情況下還需迸一步搞清 內(nèi)因，同時(shí)還需優(yōu)化大曲的分離純化，以求分離到更多的酵母 菌，為大曲微生物的消長分析提供更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)資料。 從菌種來源上分析除了原料和空氣兩大主要因素以外， 還有制曲工具、覆曲稻草等一些囡素有關(guān)。從分析結(jié)果來看， 原料為大曲提供li{f期酵母菌來源，所以在制曲過程中，除了小 麥顆粒飽滿、無蟲蛀、無霉味等～些條件以外，對(duì)不同來源產(chǎn) 地的小麥的長期微生物監(jiān)測很有必要的，另外形成一個(gè)穩(wěn)定 的空氣外部環(huán)境對(duì)穩(wěn)定大曲質(zhì)量有重要的意義。 參考文獻(xiàn)： [1]余有貫．瀘州和邵陽大曲培養(yǎng)過程中微生物的比較研究[J]．釀 酒，2005，32(2)：23—25． [2】王麗鐓，李軍，胡小松．蘋果原料中酵母菌的分離鑒定[J]．ZG農(nóng) 業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，9(4)：14一17． [3]李運(yùn)，盛慧，趙榮華．Biolog微生物鑒定系統(tǒng)在菌種鑒定中的應(yīng)用 [J]．釀灑科技．2005，(7)：84—85． [4]黃秀梨．微生物學(xué)[M]．北京：高等教育出版社，1999． [5】李金霞，程池，姚粟．Biolog徼生物自動(dòng)分析系統(tǒng)一酵母菌鑒定操 作規(guī)程的研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，(7)：50—54． [6]惠車立，柯濤，褚學(xué)莢．大區(qū)中酵母種

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