引言

高分子多層材料在很多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，而這些材料的結(jié)構(gòu)和成分也是多種多樣。高分子多層材料中每一層的厚度變化范圍很應(yīng)用文章大，可以從不足4微米到幾十微米甚至更厚。作為研究這類材料的方法，顯微紅外光譜以及顯微拉曼光譜等方法得到了較多的應(yīng)用¹。

相比于其他顯微傅里葉變換紅外光譜分析方法，ATR光譜成像是一種具有更多優(yōu)勢的比較新穎的技術(shù)，在多層材料研究中將會(huì)非常有意義。以前為了成功實(shí)現(xiàn)透射顯微紅外光譜測量，需要將樣品切成薄片（厚度在10微米左右）以避免產(chǎn)生過強(qiáng)的紅外吸收。從實(shí)際操作的角度上看，這種樣品處理方法的難度較大，也很難保持樣品的完整性。另外，不管使用哪種顯微鏡，在高度聚焦的紅外光束中放入有限厚度的樣品，都可能會(huì)影響實(shí)際所能達(dá)到的空間分辨率²。

ATR光譜成像技術(shù)可以克服上面所述的一些限制，獲得使用常規(guī)紅外顯微鏡無法或者很難觀察到的詳細(xì)信息。 首先，作為一種反射光譜技術(shù)，ATR光譜成像所測量的樣 品不需要切成很薄的樣品片，因此更容易保持樣品的完 整性。通常情況下，樣品被包埋在樹脂中或者夾在模塊之間，樣品表面被打磨平整。其次，使用ATR光譜成像測量時(shí)紅外光束所穿透的樣品厚度較低，使用鍺晶體時(shí)一般只測量1~2微米深度的樣品部分。由于不存在像空氣中樣品透射測量那樣的光束發(fā)散問題，所得到的光譜圖像更 加清晰，光譜中的干擾成分更少²。樣品制成薄膜進(jìn)行透射測試時(shí)還可能存在另一個(gè)問題。樣品內(nèi)部的多重反射會(huì)產(chǎn)生干涉條紋信號(hào)，疊加在實(shí)際測量光譜上。這一問題在ATR光譜成像測量中并不明顯。另外，能夠提供高于透射光譜成像的空間分辨率，是ATR光譜成像的另一個(gè)主要優(yōu)勢³。關(guān)于該方法的空間分辨率的分析和測試可以在另一篇技術(shù)報(bào)告中看到⁴。ATR光譜成像的空間分辨率可以優(yōu)于1.56微米，而物理衍射限制使得中紅外區(qū)的透射光譜成 像的空間分辨率是這一數(shù)值的3~4倍——而且是在假設(shè)前面提到的各種樣品問題都被克服的理想情況下。

圖1. 多層材料樣品的固定和包埋。

圖2. 薄層邊界處的紅外光譜。

專為PerkinElmer^? Spotlight傅里葉變換紅外光譜成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)的ATR光譜成像附件即可提供上述各種優(yōu)勢應(yīng)用³。該附件使用錐形鍺晶體，可以直接壓在多層材料樣品的橫截面上。該附件的另一個(gè)顯著特點(diǎn)是其相對較大的晶體面積。標(biāo)準(zhǔn)晶體的采樣區(qū)域直徑約為500微米，這意味著晶體與樣品的單次接觸即可掃描大部分樣品的完整多層結(jié)構(gòu)。此外，還可以選配直徑約為1200微米的大面積晶體。如果使用其他一些有效采樣面積很小的裝置，對多層材料樣品橫截面進(jìn)行完整測量需要讓晶體與樣品反復(fù)多次接觸。 

本報(bào)告敘述了高分子多層材料的ATR光譜成像測量方法， 為多層材料樣品的實(shí)際測量提供了一些操作建議。

實(shí)驗(yàn)

樣品處理：為了獲得優(yōu)質(zhì)的ATR光譜圖像，測量區(qū)域內(nèi)的 樣品需要與ATR晶體緊密、均勻接觸。對于波長較短的紅外光波段（例如3微米左右的C-H伸縮振動(dòng)基頻區(qū)域），這 種要求就更加重要——因?yàn)榫w與樣品界面的漸逝波強(qiáng)度在高頻區(qū)域的衰減速度更快³。為了實(shí)現(xiàn)與ATR晶體的緊密接觸，測量區(qū)域內(nèi)的多層材料樣品的表面必需平整，還需要采取適當(dāng)?shù)闹畏椒ㄒ悦獗痪w擠壓時(shí)樣品發(fā)生變形。 

有許多樣品處理技術(shù)可以使用，其中兩種方法Z為常見：一種方法是將待測樣品包埋在樹脂中然后對表面進(jìn)行拋光，另一種方法是將待測樣品直接夾持固定然后對表面進(jìn)行拋光.我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)情況下包埋法獲得的樣品一致性更好，而且實(shí)際操作也更加容易。用彈簧夾將樣品垂直夾?。ㄈ鐖D1A所示），放入模具中（如圖1B所示），注入環(huán)氧樹脂或者其他樹脂，使樹脂深度高于彈簧夾1~2毫米但是低于樣品頂端邊緣。樹脂固化之后，對樣品頂端進(jìn)行切割并拋光成平面。拋光過程一般需要使用砂紙和蒸餾水，砂紙粒度從大約30微米到大約1微米，以獲得光滑、 高度拋光的表面（如圖1C所示）。拋光后的樣品塊厚度約 為5~8毫米，直接置于ATR光譜成像附件的砧板上，然后升高砧板使樣品與晶體緊密接觸。包埋處理方法可能會(huì) 在樣品光譜圖像中引入包埋樹脂的光譜干擾，但實(shí)際上這不會(huì)對后續(xù)的數(shù)據(jù)分析造成影響（包埋樹脂與樣品的 化學(xué)成分不同）。多層材料樣品一般都具有非常清晰的邊界，數(shù)據(jù)分析軟件Hyperview可以將包埋材料對應(yīng)的光譜信息從樣品光譜圖像中屏蔽。

使用Spotlight系統(tǒng)測量多層材料樣品時(shí)，一般每個(gè)像素點(diǎn)累加掃描1~16次，光譜分辨率4~16 cm-1。由于使用了陣列檢測器，數(shù)據(jù)采集軟件可以定義任意長寬比的矩形光譜成像區(qū)域。對于多層材料來說，長而窄的光譜成像區(qū)域?qū)τ跍y量所有薄層來說是更加GX的。光譜圖像采集時(shí)間從幾分鐘到幾十分鐘不等，與測量參數(shù)有關(guān)。

結(jié)果

實(shí)例1：較高的圖像對比度 

通過查看跨越多層材料樣品兩個(gè)薄層之間狹窄邊界的光譜中不同成分的光譜特征混合情況，可以初步了解ATR光譜成像所能達(dá)到的對比度。在Spotlight儀器的出廠檢驗(yàn)中，對于空間分辨率的檢測通常使用一塊橫截面具有屋頂 式結(jié)構(gòu)的特殊高分子材料?？缭竭吔鐣r(shí)紅外光譜信號(hào)變化的陡峭程度可以被用來估計(jì)儀器的空間分辨率⁴。多層材料樣品的不同成分之間一般都會(huì)具有非常窄的邊界。圖 2顯示了這種邊界上一個(gè)聚酰胺層的光譜，光譜成像像素尺寸為1.56微米?？梢悦黠@看到，在3.12微米的距離上，聚酰胺層與相鄰薄層的光譜混合程度已經(jīng)很低，足以清晰區(qū)分不同成分構(gòu)成的薄層。如果不同成分之間的光譜差異比較明顯，在紅外光譜指紋區(qū)域可以清晰區(qū)分距離約3微米的不同成分。

實(shí)例2：包裝材料樣品 

圖3A顯示了用環(huán)氧樹脂包埋的一個(gè)包裝材料樣品橫截面的可見圖像。在這一實(shí)例中，從圖像中樣品表面的劃痕可以看出該樣品的拋光處理效果較差。盡管如此，仍然可以獲得質(zhì)量較好的ATR光譜圖像。這是因?yàn)闃悠啡犴g性比較好，可以使ATR晶體緊緊壓住其表面，而且采用的數(shù)據(jù)分析 軟件可以降低成像區(qū)域內(nèi)樣品與晶體接觸程度變化的影響。圖3B顯示了該樣品的紅外光譜重建圖像，基本不會(huì)看到劃痕的影響。 

為了在沒有任何關(guān)于樣品成分信息的情況下獲得紅外光譜重建圖像，本研究對成像光譜進(jìn)行求導(dǎo)和基線校正，然后 進(jìn)行主成分分析（PCA）。該方法可以有效地將成像光譜分為獨(dú)立的子光譜（“主成分”，或者稱為“因子”）的集合，從而對成像光譜進(jìn)行重構(gòu)。理想情況下，假設(shè)一個(gè)包含1000 張光譜的成像區(qū)域中存在5層結(jié)構(gòu)，那么只需要5種子光譜就可以描述所有1000張成像光譜。在實(shí)際應(yīng)用中，雜質(zhì)的 存在或者基線變動(dòng)、空氣吸收等對于光譜的影響使得通常需要5種以上的子光譜。由于圖像中包含大量的像素光譜，主成分分析可以非常有效地消除光譜中的大部分隨機(jī)噪聲，而且不會(huì)導(dǎo)致光譜特征峰的增寬。因此，需要在Z短的時(shí)間內(nèi)獲得樣品的概覽光譜圖像時(shí)，主成分分析是一種非常有用的探查研究工具。該方法會(huì)計(jì)算每個(gè)像素的原始圖像光譜中主成分的貢獻(xiàn)（或者稱為“得分”），而Z后生成的得分圖像對于提高紅外光譜圖像的對比度非常有用。圖 4顯示了本研究所用樣品的前7個(gè)主成分的得分圖像。主成分分析結(jié)果顯示了該樣品所有的主要層級(jí)結(jié)構(gòu)，還提供了一些微小的細(xì)節(jié)信息。diyi主成分的得分圖像對應(yīng)于包埋介質(zhì)。

圖3. 包埋多層材料的可見圖像和紅外光譜重建圖像。

圖4. 主成分得分圖像。

       如圖5所示，第二和第三主成分的得分圖像顯示了該多層材 料樣品的主要分層，即聚乙烯層和聚酰胺層。第四主成分的得分圖像表明在聚乙烯層和聚酰胺層之間存在厚度約為6微米的過渡層。通過分析不同類型像素的原始成像光譜，可以比較容易地識(shí)別各個(gè)分層的成分。另外，圖6和圖7所示的第五和第六主成分的得分圖像顯示了一些微小的光譜差異。第五主成分的得分圖像表明靠近樣品外表面處存在一個(gè)3~4微米厚的薄層。使用Spotlight的圖層管理功能，可以 查看對應(yīng)的像素光譜，以1.56微米的步距跟蹤光譜的變化。 該薄層的像素光譜中存在獨(dú)特的羰基特征峰，而其兩側(cè)的像素光譜中都沒有該特征峰，說明該薄層的化學(xué)成分與其 他薄層明顯不同。相比之下，圖7顯示了另外一種情況。第六主成分的得分圖像也表明存在一個(gè)“薄層”，但是對應(yīng)的像素光譜沒有獨(dú)特的化學(xué)成分特征，僅僅表現(xiàn)為兩種材料的過渡導(dǎo)致的光譜強(qiáng)度逐漸變化。這種干擾的出現(xiàn)是由于樣品中存在脊線等物理邊界，而不是因?yàn)榛瘜W(xué)成分的差異。

圖5. 第二、第三和第四主成分的得分圖像。

圖6. 第五主成分的得分圖像。

圖7. 第六主成分的得分圖像。

實(shí)例3：顯示精細(xì)的結(jié)構(gòu) 

本實(shí)例所用的多層膜樣品由常見材料構(gòu)成，但是具有厚度不到5微米的過渡層。與上一個(gè)樣品的處理方法一樣，該樣品也用樹脂包埋并進(jìn)行拋光。ATR光譜成像的測試面積為 150微米x150微米，光譜分辨率為8 cm^-1。圖8顯示了該樣 品的可見圖像，其中紅色邊界內(nèi)為ATR光譜成像區(qū)域。使用 Spotlight中的Show Structure功能和相對峰高度方法對成像光譜進(jìn)行解析。疊加的主成分得分圖像（如圖9所示）清楚顯示了包埋材料與樣品膜的不同，后者的主要薄層（聚乙烯）以綠色顯示。本樣品中引人注意的是較厚的聚乙烯層下面的薄層結(jié)構(gòu)。主成分得分圖像顯示該樣品中存在超過3種化學(xué)成分。如果成分種類不超過3種，使用簡單的紅綠藍(lán)（RGB）圖像就可以獲得易于觀察的組合結(jié)果。但是，以這種方式顯示3種以上成分或者顏色可能會(huì)遇到一些問題，特別是不同成分間存在重疊時(shí)。含有多種成分的重疊像素可以表示為多種顏色的疊加：白色，黑色，或者其他顏色。這必然給圖像解析增加了難度。Spotlight的圖層管理功能可以改變重疊像素的顯示規(guī)則，例如，只顯示強(qiáng)度Z高的顏色以改變光譜圖像的對比度。與原始像素光譜分析相結(jié)合，這一功能可以有效增強(qiáng)光譜圖像的對比度。圖 10顯示了該樣品的復(fù)合得分圖像，首先以平均顏色顯示疊 加像素，然后以Z強(qiáng)成分顏色顯示疊加像素。后者對于光 譜圖像質(zhì)量的改善是非常顯著的，而對應(yīng)的原始像素光譜 （如圖11所示）證明不同顏色區(qū)域確實(shí)存在不同的化學(xué)成分。在所有薄層都得到滿意地表征之后，可以調(diào)整單個(gè)得分圖像的亮度和對比度，然后對多個(gè)得分圖像進(jìn)行疊加，以獲得Z佳的顯示結(jié)果。圖12顯示了將各個(gè)主成分的得分圖像導(dǎo)入ImageJ軟件5處理后得到的復(fù)合圖像。

圖10. 使用色彩疊加功能增強(qiáng)細(xì)節(jié)信息。

圖11. 各個(gè)薄層對應(yīng)的紅外光譜。

討論

上述實(shí)例表明了ATR光譜成像附件對高分子多層材料的測試和表征能力。通過這些實(shí)例可以看出，樣品包埋處理方法非常有效，不會(huì)或者極少導(dǎo)致樣品發(fā)生降解。在不知道樣品的化學(xué)成分信息時(shí)，主成分分析是一種非常有效的方法（相比于相對峰高度法），可以提供樣品的概覽光譜圖像，還能夠揭示精細(xì)結(jié)構(gòu)的存在。然而，對主成分分析所產(chǎn)生的得分圖像與原始光譜進(jìn)行對比觀察，以確認(rèn)得分圖像的化學(xué)成分還是非常必要的。因?yàn)橹鞒煞址治鲆矔?huì)顯示樣品的物理和形貌結(jié)構(gòu)，可能會(huì)與化學(xué)成分差異相混淆。為了更好地顯示計(jì)算出的光譜圖像，用不同方式顯示重疊像素是值得考慮的，但是所得結(jié)果仍然要通過原始像素光譜進(jìn)行確認(rèn)。Spotlight系統(tǒng)所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量一般足以直接用于在商業(yè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，為譜圖解析提供幫助。很多樣品的測試結(jié)果都說明了這種做法的可行性，具體數(shù)據(jù)沒有在本報(bào)告中顯示。使用的數(shù)據(jù)庫中包含透射方法獲得的光譜時(shí)，在進(jìn)行搜索之前對樣品光譜進(jìn)行ATR校正以減少與波長相關(guān)的吸光度變化，有可能提高搜索結(jié)果的質(zhì)量。

結(jié)論

在高分子多層材料樣品的分析中，使用Spotlight傅里葉變換紅外光譜成像系統(tǒng)，ATR光譜成像技術(shù)的很多優(yōu)勢超越 了已經(jīng)過驗(yàn)證的透射紅外光譜成像技術(shù)。除了在一定程度上簡化樣品處理方法、降低干涉條紋等光譜干擾的風(fēng)險(xiǎn)以外，ATR光譜成像技術(shù)可以提供更高的空間分辨率。厚度為 4微米或者更薄的薄層都可以得到有效識(shí)別。多層材料中含有粘結(jié)劑或者其他成分構(gòu)成厚度低于5微米的薄層時(shí)， 這種空間分辨能力尤為重要。因此，ATR光譜成像技術(shù)在高分子多層材料分析中的應(yīng)用必定會(huì)在未來幾年內(nèi)會(huì)迅速增長。

參考文獻(xiàn)

1. See, for example, ‘Raman Microscopy,’ P. Dhamelincourt, in Handbook of Vibrational Spectroscopy, Vol. 2, 1419, Wiley (2002).

2. ‘Mid-Infrared Transmission Microspectroscopy,’ A.J. Sommer, in Handbook of Vibrational Spectroscopy, Vol. 2, 1369, Wiley (2002).

3. A. Canas, R. Carter, R. Hoult, J. Sellors, and S. Williams, Spatial Resolution in Mid-IR ATR Imaging: Measurement and Meaning, FACCS Conference (2006).

4. ‘Spatial Resolution in FT-IR ATR Imaging,’PerkinElmer Technical Note No. 007641_03 (2006).

5. W.S. Rasband and J. Image, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/(1997-2006).

作者：查姍姍

       如果利用常規(guī)的透射法對大尺寸（肉眼可見）的微塑料進(jìn)行定性，需要對樣品進(jìn)行破壞（熱壓膜或者溶解后涂抹法），無法做到原位檢測。借助ATR（衰減全反射）法，可以直接、原位地對樣品進(jìn)行檢測。

      本文介紹了利用珀金埃爾默Frontier紅外光譜儀對微塑料樣品進(jìn)行ATR-紅外光譜法檢測的實(shí)例。

      -適于大尺寸微塑料（> 100 μm）的定性 ；

      -有效減少樣品前處理工作，實(shí)現(xiàn)原位檢測 ；

      -鉆石壓頭，不易磨損，便于清潔 ；

      -智能型壓力傳感器保證壓頭與樣品間實(shí)現(xiàn)Z優(yōu)接觸，提升儀器靈敏度與數(shù)據(jù)重復(fù)性 ；

      -ATR模式可被儀器自動(dòng)識(shí)別，并且軟件可以實(shí)時(shí)顯示壓力值，保證測試條件的一致性。

       檢測過程： 樣品經(jīng)過前處理凈化后，直接挑揀出來放在ATR附件的測試晶體上，旋下ATR壓力桿壓緊樣品，即可開始采集譜圖。

實(shí)際海水樣品中微塑料的定性檢測-ATR法直接檢測并譜庫檢索結(jié)果：A-聚乙烯，B-滌綸，C-PET，D-聚苯乙烯 

       由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，利用ATR-紅外光譜法對大尺寸微塑料樣品進(jìn)行檢測，具有過程簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)勢。

細(xì)胞因子是腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment,TME）中細(xì)胞通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、治 療和預(yù)后等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。在過去的 40 年中，細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體作為癌癥靶點(diǎn)或癌癥治 療方法得到了廣泛的研究。目前公認(rèn)的臨床前治 療策略為增強(qiáng)干擾素和白細(xì)胞介素（包括 IL-2 ，IL-7 ，IL-12 和 IL-15 ）的生長抑 制和免疫刺激作用，或抑 制細(xì)胞因子（如 TNF ，IL-1β 和 IL-6 ）的炎癥和促進(jìn)腫瘤的作用[1]。

圖 1 . 細(xì)胞因子在腫瘤微環(huán)境中的作用

特定細(xì)胞因子的表達(dá)也與腫瘤細(xì)胞的高存活率和高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。其中促炎細(xì)胞因子 IL-6 和 IL-8 與多種癌癥相關(guān)，包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌等 [2,3]。因此，分析細(xì)胞因子的表達(dá)是一種重要的診斷工具和預(yù)測癌癥預(yù)后的關(guān)鍵因素。

非放射性的 RNA 原位雜交技術(shù)（ViewRNA ISH）是一種高靈敏度的檢測細(xì)胞因子表達(dá)的有效方法，并且可以對 1 至 4 個(gè) mRNA 目標(biāo)進(jìn)行多重分析。

檢測原理如下圖所示：

圖 2 .  ViewRNA ISH 檢測原理

安捷倫BioTek Cytation 5 多功能細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)，可容納多達(dá)四個(gè)熒光通道同時(shí)成像，快速并出色地成多色熒光成像。儀器配備的高內(nèi)涵分析軟件可自動(dòng)計(jì)算細(xì)胞內(nèi) RNA 的表達(dá)水平。Cytation 5 活細(xì)胞成像工作站結(jié)合ViewRNA ISH，為細(xì)胞因子研究提供了一種高效率、高靈敏度和可重復(fù)的檢測方法。

實(shí)驗(yàn)案例分享

 實(shí)驗(yàn)一．細(xì)胞因子mRNA的成像和分析 

為研究細(xì)胞因子mRNA 在不同營養(yǎng)條件下的表達(dá)情況，設(shè)置兩組對照實(shí)驗(yàn)。陽性對照細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，而陰性對照細(xì)胞經(jīng)過 18 小時(shí)的血清饑餓處理。隨后加入 ViewRNA 探針以標(biāo)記 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ，在Cytation 5 上分別使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道對探針進(jìn)行成像完成 ISH 細(xì)胞分析。圖像結(jié)果表明：細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá)在營養(yǎng)匱乏的條件下會(huì)顯著降低。

圖 3 . 陽性和陰性對照組成像。HCT116 放大 20 倍圖像作為（ A ）陽性對照和（ B ）陰性對照。MDA-MB-231 細(xì)胞放大 40 倍的圖像作為（ C ）陽性對照和（ D ）陰性對照。藍(lán)色：DAPI 染色的細(xì)胞核；綠色：標(biāo)記 IL-8 mRNA ；橙色：標(biāo)記 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記 ACTB mRNA 。

接下來為了定量分析細(xì)胞因子表達(dá)，首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)，以確定每孔的細(xì)胞數(shù)量（圖 4A ）。然后分別在GFP 、RFP 通道進(jìn)行細(xì)胞因子探針（ IL-6 或 IL-8 ）的熒光信號(hào)分析（圖 4B ）。通過細(xì)胞熒光信號(hào)的比率評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞因子表達(dá)（圖 5 ）。

圖 4 . 每個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 軟件進(jìn)行細(xì)胞分析圈選出 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核；( B ) 熒光標(biāo)記的 IL-8 信號(hào)的圖像分析。

如圖 5 所示，使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合準(zhǔn)確的量化了細(xì)胞內(nèi) IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達(dá)。

圖 5 . MDA-MB-231 細(xì)胞中 IL-8 表達(dá)和 HCT116 細(xì)胞中 IL-6 表達(dá)，并以細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行校正。

 實(shí)驗(yàn)二．誘導(dǎo)細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá) 

使用不同劑量的 IL-1β 刺激 DU145 細(xì)胞，以分析細(xì)胞因子的 mRNA 的表達(dá)（圖6）。圖 7 結(jié)果顯示：雖然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表達(dá)增加，但 IL-8 的表達(dá)變化更為顯著，這與先前研究結(jié)果一致[4]。IL-1β 的最 高劑量下，這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)減少則是由于細(xì)胞毒性。這驗(yàn)證了該檢測方法的可行性與穩(wěn)定性。

圖 6 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號(hào) ( A ) 0 ng/mL；( B ) 0.02 ng/mL ；0.128 ng/mL；( D ) 0.8 ng/mL。藍(lán)色：DAPI染色的細(xì)胞核；綠色：標(biāo)記的IL-8 mRNA；橙色：標(biāo)記的 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記的 ACTB mRNA 。

圖 7 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下 DU145 細(xì)胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達(dá)。

 實(shí)驗(yàn)三．抑 制細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá) 

研究表明絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）可調(diào)節(jié) IL-8 ，并證明用 MAPK/ERK 抑 制劑 U 0126 治 療可減少 DU145 和 MDA-MB-231 細(xì)胞中的炎癥細(xì)胞因子[4,5]。為了確認(rèn)這一現(xiàn)象并驗(yàn)證 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合的能力，將不同濃度的 U 0126 加入到每種細(xì)胞類型中孵育 30 分鐘。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 細(xì)胞達(dá) 3 小時(shí)，而 MDA-MB-231 細(xì)胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和圖像分析以評(píng)估在 U 0126 治 療后 IL-8 和 IL-6 細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)。采集的圖像（圖 8 ）和計(jì)算的熒光信號(hào)強(qiáng)度 （圖 9 ）證實(shí)了 U 0126 的抑 制作用。此外，也驗(yàn)證了該方法的靈敏度，可以準(zhǔn)確識(shí)別給予抑 制劑后 mRNA 的表達(dá)變化。

圖 8. U 0126 抑 制 IL-8 mRNA 的表達(dá)。圖像顯示了在不同濃度的 U 0126 處理后 ( A-E ) MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi) IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號(hào)；( F-J ) 為 DU145 細(xì)胞。藍(lán)色：DAPI 染色的細(xì)胞核；綠色：標(biāo)記的 IL-8 mRNA ；橙色：標(biāo)記的 IL-6 mRNA ；紅色：標(biāo)記的 ACTB mRNA 。

圖 9 . U 0126 治療后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié) 語

ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 細(xì)胞分析試劑盒和探針提供一種靈敏的方法來檢測 mRNA 表達(dá)。該方法在安捷倫BioTek Cytation 5 細(xì)胞成像系統(tǒng)的加持下得以更更快地采集多熒光通道的圖像，并更精 準(zhǔn)的計(jì)算出每一個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度。這種檢測、成像和分析的完 美結(jié)合提供了一種靈敏、靈活和高通量的方法用以檢測細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.

[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.

[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.

[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.

[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18. 

微透鏡

(a) 為微透鏡的大視野3D圖像，通過hitachi MAP 3D 將多張3D 圖像拼接而成。

(b) 為（a）中紅框部分的形貌像。通過顏色標(biāo)尺很容易確定高度信息。

(c)(d)是提取的圖.1(b)中劃線區(qū)域的結(jié)果，可以獲得每個(gè)透鏡（箭頭 0-1, 2-3）的水平距離、垂直高度以及頂部和底部的角度。

所以，使用Hitachi Map 3D可以獲得大視野3D圖像和截面輪廓信息。

(a)拼接后的3D圖像(x2k), (b)紅框內(nèi)的形貌圖

（c）(b)中劃線區(qū)域的截面

觀察機(jī)型：FlexSEM1000 

觀察條件：5 kV, 2000倍, 30Pa 軟件：Hitachi Map 3D

Material

【大視野3D觀察】

FlexSEM1000

題：The mIRage IR+Raman Dual Channel Microspectroscopy: Particle and Contamination Analysis

[報(bào)告簡介]

    顆粒物無處不在，氣溶膠、PM2.5、灰塵、棉絮、污染物、微塑料、藥物粉末和化學(xué)殘留物對生活的方方面面都有著很大的影響。對這些微粒的積極識(shí)別有助于確定它們在人體內(nèi)的潛在影響，并可以揭示這種物質(zhì)的來源，作為未來消除這種影響的一步。

    然而，識(shí)別單個(gè)粒子的化學(xué)組成對分析科學(xué)提出了重大挑戰(zhàn)，因?yàn)轭w粒物的尺寸通常比紅外光的波長更小。傳統(tǒng)較弱的紅外光源加上小于10 μm的顆粒尺寸，會(huì)導(dǎo)致明顯的光譜噪聲，難以進(jìn)行有效的組成識(shí)別。更加復(fù)雜的是，小顆粒銳利邊緣的散射像差會(huì)導(dǎo)致紅外峰的漂移和異常的帶形狀。這些困難大大降低了人們正確解釋小粒子紅外光譜結(jié)果的信心。通常認(rèn)為，傳統(tǒng)的FTIR僅可以可靠地分析大于20 μm的粒子。盡管使用了新型紅外激光器（如QCL激光器），小顆粒的紅外吸收變化仍然很小，實(shí)際的空間分辨率在5 ~ 20微米之間, 而由于散射像差引發(fā)的數(shù)據(jù)和光譜信息的可譯性差也未能得到改善。

    PSC (Photothermal Spectroscopy Corp. )公司新發(fā)布的mIRage亞微米IR+Raman顯微鏡將獨(dú)特的光學(xué)光熱紅外(O-PTIR)技術(shù)與同步拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，直接解決了上述挑戰(zhàn)。該系統(tǒng)利用固定波長的探測光束直接感應(yīng)材料的光熱變化，從而提供可靠的紅外吸收光譜。這種方法對小到幾百納米的粒子提供了較高的靈敏度。盡管粒子直徑很小，這些光譜的紅外吸收帶不含任何散射像差，并可在常規(guī)紅外數(shù)據(jù)庫中搜索來實(shí)現(xiàn)快速的未知物種鑒定。另外同步拉曼顯微鏡為O-PTIR光譜在同一位置、同一時(shí)間、同一分辨率下提供了補(bǔ)充和驗(yàn)證的結(jié)果。這一獨(dú)特的功能只需簡單的鼠標(biāo)點(diǎn)擊，即可提供無與倫比的物種識(shí)別信心，并顯著節(jié)省時(shí)間，從獲得兩個(gè)獨(dú)立的光譜數(shù)據(jù)通道。

    在這次研討會(huì)中，Mike Lo博士將深入探討基于O-PTIR技術(shù)的mIRage顯微光譜和IR+Raman技術(shù), 并結(jié)合幾個(gè)具體的應(yīng)用案例，來探討它們在分析顆粒物方面的顯著優(yōu)勢。我們誠摯歡迎各位前來Quantum Design北京實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行mIRage紅外+拉曼同步測量系統(tǒng)樣機(jī)的參觀和使用。

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[主講人介紹]

Michael K. Lo  博士

美國加州大學(xué)洛杉磯分校獲得化學(xué)和生物分子工程博士學(xué)位，并獲得項(xiàng)目管理專業(yè)認(rèn)證 (PMP)。目前是美國PSC公司亞太地區(qū)應(yīng)用和業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理，擁有15年以上的儀器相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，涉及從IR/Raman, AFM和電子顯微鏡到材料合成和聚合物組成調(diào)配等研究領(lǐng)域。他在超越傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限的紅外儀器的開發(fā)和應(yīng)用方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)。

[報(bào)告時(shí)間]

開始  2020年07月24日  14:00

結(jié)束  2020年07月24日  15:00

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[直播好禮]

看直播贏好禮，更多大獎(jiǎng)：藍(lán)牙運(yùn)動(dòng)手環(huán)、智能測溫水杯、多功能數(shù)據(jù)線... ...

目前在光伏業(yè)界，正在進(jìn)行一項(xiàng)重大努力，以提高光伏和發(fā)光應(yīng)用中所用半導(dǎo)體的效率并降低相關(guān)成本。這就需要探索和開發(fā)新的制造和合成方法，以獲得更均勻、缺陷更少的材料。

無論是電致還是光致發(fā)光，都是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要工具。通過發(fā)光可以深入了解薄膜內(nèi)部發(fā)生的重組過程， 而無需通過對完整器件的多層電荷提取來解決復(fù)雜問題。

HERA高光譜照相機(jī)是繪制半導(dǎo)體光譜成像的理想設(shè)備，因?yàn)樗軌蚩焖佟⒍康乩L制半導(dǎo)體發(fā)射光譜圖，且具有高空間分辨率和高光譜分辨率的特性。

硅太陽能電池的電致發(fā)光光譜成像

光伏設(shè)備中的缺陷會(huì)導(dǎo)致光伏產(chǎn)生的載流子發(fā)生重組，阻礙其提取并降低電池效率。電致發(fā)光光譜成像可以揭示這些有害缺陷的位置和性質(zhì)。

"反向"驅(qū)動(dòng)太陽能電池（即施加電流）會(huì)產(chǎn)生電致發(fā)光，因?yàn)檩d流子在電極上被注入并在有源層中重新結(jié)合。在理想的電池中，所有載流子都會(huì)發(fā)生帶間重組，這在硅中會(huì)產(chǎn)生1100 nm附近的光（效率非常低）。然而，晶體結(jié)構(gòu)中的缺陷會(huì)產(chǎn)生其他不利的重組途徑。雖然這些過程通常被稱為"非輻射"重組，但偶爾也會(huì)產(chǎn)生光子，其能量通常低于帶間發(fā)射。捕獲這些非常罕見的光子可以了解缺陷的能量和分布。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了HERA SWIR (900-1700 nm)，它非常適合測量硅發(fā)光衰減。測量裝置如圖1所示：HERA安裝在三腳架上，在太陽能電池上方，連接到一個(gè)10A的電源。640×512像素的傳感器安裝在樣品上方75厘米處，空間分辨率約為250微米。

圖1. 實(shí)驗(yàn)裝置

最重要的是，HERA光學(xué)系統(tǒng)沒有輸入狹縫，因此光通量非常高，是測量極微弱光發(fā)射的理想選擇。

圖2.A和2.B顯示了兩個(gè)波長的電致發(fā)光（EL）圖像：1150 nm（帶間發(fā)射）和1600 nm（缺陷發(fā)射），這是4次掃描的平均值（總采集時(shí)間：5分鐘）。通過分析這些圖像，我們可以看到，盡管缺陷區(qū)域的亮度遠(yuǎn)低于主發(fā)射區(qū)域，但它們?nèi)员磺逦胤直娉鰜怼４送?，具有?qiáng)缺陷發(fā)射的區(qū)域的帶間發(fā)射相對較弱。

我們可以注意到有幾個(gè)區(qū)域在兩個(gè)波長下都是很暗的；這可能是由于樣品在運(yùn)輸過程中損壞了電池造成的。

圖2.C中以對數(shù)標(biāo)尺顯示了小方塊感興趣區(qū)域（圖2A和2B中所示）的光譜。

圖 2.A 和 B：兩個(gè)選定波長（1150 nm 和 1600 nm）的電致發(fā)光（EL）圖像。C：A和B中三個(gè)不同區(qū)域?qū)?yīng)的電致發(fā)光光譜（圖像中的彩色方框）。

金屬鹵化物鈣鈦礦薄膜的光致發(fā)光顯微研究

通過旋涂等技術(shù)含量低、成本效益高的方法，可以制造出非常高效的太陽能電池和LED。這些方法面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是在微觀長度的尺度上保持均勻的成分。光致發(fā)光顯微鏡是表征這種不均勻性的一個(gè)特別強(qiáng)大的工具。

HERA高光譜相機(jī)可以連接到任何顯微鏡（正置或倒置）的c-mount相機(jī)端口，并直接開始采集高光譜數(shù)據(jù)，無需任何校準(zhǔn)程序。

圖3. 與尼康LV100直立顯微鏡連接的HERA VIS-NIR。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用HERA VIS-NIR（400-1000 nm）耦合到尼康LV100直立顯微鏡（圖3）來表征兩種鹵化物前驅(qū)體合金的帶隙分布。將兩種鹵化物前驅(qū)體合金化的優(yōu)點(diǎn)是能夠調(diào)整材料的帶隙；然而，這兩種成分經(jīng)常會(huì)發(fā)生逆混合，從而導(dǎo)致性能損失。

本實(shí)驗(yàn)的目的是檢測這種逆混合現(xiàn)象：事實(shí)上，混合比的局部變化會(huì)改變局部帶隙，從而導(dǎo)致發(fā)射不同能量的光子。

在這種配置中，激發(fā)光來自汞燈，通過帶通濾光片在350 nm處進(jìn)行濾光，并通過發(fā)射路徑上的二向色鏡將其從相機(jī)中濾除。

HERA的高通量使其能夠在大約1分鐘的測量時(shí)間內(nèi)收集完整的數(shù)據(jù)立方體（130萬個(gè)光譜）。

圖4.樣品的光譜綜合強(qiáng)度圖（A：全尺寸；B：放大）。

圖4.A和4.B分別顯示了所有波長（400-1000 nm）總集成信號(hào)的全尺寸和放大圖像，揭示了長度尺度在1 μm左右的明亮特征。

當(dāng)我們比較亮區(qū)和暗區(qū)的光譜時(shí)（圖5.B中的黑色和紅色曲線），我們發(fā)現(xiàn)暗區(qū)實(shí)際上也有發(fā)射， 不僅強(qiáng)度較低，而且波長中心比亮區(qū)短。事實(shí)上，光譜具有雙峰形狀，很可能與逆混合前驅(qū)體的發(fā)射相對應(yīng)。圖5.A的發(fā)射圖清楚地顯示了帶隙的這種變化。

我們現(xiàn)在可以理解為什么低帶隙區(qū)域看起來更亮了--載流子可能從高帶隙區(qū)域弛豫到那里，并且在發(fā)生輻射重組之前無法返回。

圖5.A：顯示平均發(fā)射波長的強(qiáng)度圖。B：亮區(qū)和暗區(qū)的發(fā)射光譜（正常化）。

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