微透鏡

(a) 為微透鏡的大視野3D圖像，通過hitachi MAP 3D 將多張3D 圖像拼接而成。

(b) 為（a）中紅框部分的形貌像。通過顏色標(biāo)尺很容易確定高度信息。

(c)(d)是提取的圖.1(b)中劃線區(qū)域的結(jié)果，可以獲得每個(gè)透鏡（箭頭 0-1, 2-3）的水平距離、垂直高度以及頂部和底部的角度。

所以，使用Hitachi Map 3D可以獲得大視野3D圖像和截面輪廓信息。

(a)拼接后的3D圖像(x2k), (b)紅框內(nèi)的形貌圖

（c）(b)中劃線區(qū)域的截面

觀察機(jī)型：FlexSEM1000 

觀察條件：5 kV, 2000倍, 30Pa 軟件：Hitachi Map 3D

Material

【大視野3D觀察】

FlexSEM1000

全場景顯微成像分析平臺(tái)MICA集3D采集和AI定量于一體。

3D組織成像廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。研究人員利用它來揭示組織組成和完整性的詳細(xì)信息，或從實(shí)驗(yàn)操作中得出結(jié)論，或比較健康與不健康的樣本。本文介紹了MICA如何幫助研究人員進(jìn)行3D組織成像。

3D組織成像

模式生物或患者的組織切片可用于分析從組織到細(xì)胞的各種形態(tài)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)健康和非健康樣本以及對照樣品和實(shí)驗(yàn)樣品之間的差異。例如，是否存在特定細(xì)胞或它們的形態(tài)（即形狀、體積、長度、面積）都是有意義的參數(shù)。

熒光顯微鏡有助于識(shí)別特定標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞成分。因此，要么用轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記基因生物，要么用免疫熒光染色。此外，某些基因和轉(zhuǎn)錄也可以通過熒光原位雜交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 進(jìn)行可視化。

3D組織成像的一個(gè)示例是，對腦部神經(jīng)元進(jìn)行成像，以確定它們的長度、體積或與其它細(xì)胞的連接。例如，可以對患有局部腦缺血的模式生物制作腦部切片，以了解形態(tài)差異和細(xì)胞數(shù)量。

挑戰(zhàn)

首要的挑戰(zhàn)之一是使用顯微鏡初步觀察樣本。需要將樣本置于載物臺(tái)上并不斷調(diào)整三維位置以確保對樣本進(jìn)行正確成像。你從目鏡或屏幕上看到的只是樣本極小的一部分。因此，要將樣本保持在正確的焦距內(nèi)并找到正確位置，以便找到感興趣的區(qū)域，是一個(gè)非常麻煩的過程。MICA的樣本查找功能通過將樣本聚焦并生成每個(gè)相關(guān)區(qū)域的低倍率預(yù)覽圖來自動(dòng)化這個(gè)過程，這個(gè)功能可以用于整個(gè)成像過程的定位。

下一個(gè)挑戰(zhàn)是設(shè)置成像參數(shù)，因此可以在看到感興趣的信號(hào)下，避免樣本遭受不必要的光漂白。這一步驟通常要同時(shí)選擇激發(fā)和接受檢測的技術(shù)參數(shù)，因?yàn)槊恳豁?xiàng)參數(shù)都會(huì)對樣本和獲得的結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。使用MICA，您只需輕輕點(diǎn)擊一下“Live”，便可自動(dòng)完成可視化熒光所需的所有參數(shù)設(shè)置?？呻S時(shí)通過點(diǎn)擊“OneTouch”執(zhí)行這一自動(dòng)化設(shè)置來優(yōu)化當(dāng)前視圖的參數(shù)。更改顯微鏡的特定技術(shù)參數(shù)前，實(shí)驗(yàn)人員通常需要了解更改參數(shù)將產(chǎn)生的影響，但在MICA中，設(shè)置是輸出驅(qū)動(dòng)型的，也就是說，可定義所需的輸出，然后自動(dòng)完成對應(yīng)的調(diào)整。

一般而言，第一步是確定要成像的正確位置。實(shí)驗(yàn)人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數(shù)字顯微鏡可以生成樣本的概覽，這可以提供一些幫助，但實(shí)驗(yàn)人員仍然需要指出圖像中要進(jìn)一步成像的位置。MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低倍或高倍的預(yù)覽，輕松定位感興趣的區(qū)域，并可以使用工具直接在圖像上標(biāo)記出感興趣的樣本區(qū)域。這樣后續(xù)高分辨率圖片就可以保存下來。

高放大倍數(shù)物鏡通常需要使用浸沒式介質(zhì)，最常見的是水和油。水為水溶液中的成像樣品匹配了最佳的光學(xué)指數(shù)，而油為包埋的成像樣品匹配了最佳的光學(xué)指數(shù)。水浸物鏡也可用于固定式樣本，但會(huì)稍微影響成像質(zhì)量。MICA可同時(shí)滿足兩種需求。水鏡還具有全自動(dòng)化操作的額外優(yōu)勢，水的浸入可以自動(dòng)建立并維持。為進(jìn)一步提高光學(xué)質(zhì)量，一些物鏡會(huì)通過校正環(huán)來補(bǔ)償樣本板的厚度。校正環(huán)可手動(dòng)、也可自動(dòng)操作。MICA配置了自動(dòng)校正環(huán)功能，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)優(yōu)化。

相對厚度是組織切片成像的另一大挑戰(zhàn)。厚切片會(huì)形成較多的散射光，干擾所需信號(hào)。THUNDER可減少背景模糊，為組織成像提供了一種寶貴的計(jì)算成像方法。 MICA集THUNDER于一體，可在合理的時(shí)間范圍內(nèi)確定感興趣的區(qū)域，

除了類似于THUNDER的計(jì)算清除方法，共聚焦激光掃描顯微術(shù)(CLSM)等光學(xué)部分也是3D組織玻片成像的一種方法。這種方法中，可獲得性和可用性方面也是挑戰(zhàn)。

除了技術(shù)設(shè)置比較復(fù)雜，共聚焦顯微鏡所需的培訓(xùn)時(shí)間一般也更長。MICA集共聚焦和寬場成像于一體，最大程度減少了成像參數(shù)設(shè)置，縮短了所需的培訓(xùn)時(shí)間，同時(shí)也降低了操作顯微鏡的技能要求。

另外，共聚焦和寬場成像模式的圖像設(shè)置有相同的外觀和使用感受，因此，用戶無需學(xué)習(xí)兩種系統(tǒng)的操作方法。而且，用戶可隨意在寬場和共聚焦兩種模式間切換而無需在兩種成像系統(tǒng)間轉(zhuǎn)移樣本。

科學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵方面是，改變盡可能少的變量，以確定對樣本和結(jié)果的任何影響。除了保證樣本處理相同外，另一個(gè)方面是針對激發(fā)和接收檢測成像參數(shù)相同。MICA默認(rèn)在不同項(xiàng)目中保持成像參數(shù)不變，用戶僅基于自己的需求進(jìn)行調(diào)整?？筛鶕?jù)參考圖像輕松恢復(fù)成像參數(shù)。

方法

三個(gè)厚度為250μm的小鼠腦部切片包含下述熒光標(biāo)記物：

· 細(xì)胞核（DAPI，品紅色）

· 神經(jīng)元（細(xì)胞質(zhì)GFP，青色）

· 星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP-DsRed，紅色）

將切片固定于載玻片支架中（圖1）并置于載物臺(tái)上進(jìn)行成像。

圖2： MICA在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行完整的玻片預(yù)覽（寬場），便于更輕松地定位。

借助該信息的信息，可找到大圖掃描拼接的感興趣區(qū)域?？墒褂肕agic Wand工具自動(dòng)化檢測感興趣區(qū)域。

MICA可同時(shí)采集最多四個(gè)熒光團(tuán)，因此相比基于濾光塊的序列成像的顯微系統(tǒng)，可有效節(jié)約用戶的時(shí)間。在單次掃描拼接中，可找到感興趣區(qū)域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍數(shù)觀察更多的細(xì)節(jié)。

二維圖像需要借助三維數(shù)據(jù)以獲得更詳細(xì)的信息。為此，z界面中定義了三維立體模式。

在CLSM下進(jìn)行立體采集后（120μm厚），可在三維觀察器中可視化數(shù)據(jù)，獲得腦部樣本的更多空間信息。

 圖3：三維重構(gòu)CLSM。

通過三維采集進(jìn)一步研究組織切片。利用獲得的三維信息，用戶可以更好地了解樣本的空間狀況，例如了解細(xì)胞間的連接。

對于定量來說，可根據(jù)三維采集信息生成最大投影來測量樣本樹突棘的平均面積。pixel classifier識(shí)別棘突，分析工具則確定面積。得到的數(shù)值可繪制成圖，以可視化數(shù)據(jù)和相關(guān)性。圖4顯示了樹突棘面積的直方圖。這些結(jié)果也可通過箱線圖的形式顯示，來比較不同的樹突棘群落（圖4）。

圖4：分析。

MICA不僅采集圖像，還可對它們進(jìn)行分析。為此，可使用基于人工智能技術(shù)的pixel classifier來識(shí)別相關(guān)的圖像細(xì)節(jié)。隨后，識(shí)別出的對象可以被量化并顯示在圖形中。在本示例中，樹突棘的平均面積在最大投影上測量。

結(jié)論

MICA是用于三維組織成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用戶可以快速了解樣本的整體質(zhì)量，確定進(jìn)一步的操作。隨后，Navigator視圖可對組織切片進(jìn)行更深入的觀察。Magic Wand等工具用于快速定義感興趣的區(qū)域，加上4個(gè)通道的同時(shí)成像，可加快大圖掃描拼接的速度。使用新的z界面使三維采集更加簡化，pixel classifier能輔助后續(xù)分析。

簡而言之，MICA集寬場成像和共聚焦成像于一個(gè)系統(tǒng)中。它可以幫助用戶在一個(gè)系統(tǒng)中完成從圖像預(yù)覽到三維細(xì)節(jié)成像再到分析的整個(gè)工作流程。

全場景顯微成像分析平臺(tái)MICA集3D采集和AI定量于一體。

3D組織成像廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。研究人員利用它來揭示組織組成和完整性的詳細(xì)信息，或從實(shí)驗(yàn)操作中得出結(jié)論，或比較健康與不健康的樣本。本文介紹了MICA如何幫助研究人員進(jìn)行3D組織成像。

3D組織成像

模式生物或患者的組織切片可用于分析從組織到細(xì)胞的各種形態(tài)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)健康和非健康樣本以及對照樣品和實(shí)驗(yàn)樣品之間的差異。例如，是否存在特定細(xì)胞或它們的形態(tài)（即形狀、體積、長度、面積）都是有意義的參數(shù)。

熒光顯微鏡有助于識(shí)別特定標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞組分。因此，要么用轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記基因生物，要么用免疫熒光染色。此外，某些基因和轉(zhuǎn)錄也可以通過熒光原位雜交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 進(jìn)行可視化。

3D組織成像的一個(gè)示例是，對腦部神經(jīng)元進(jìn)行成像，以確定它們的長度、體積或與其它細(xì)胞的連接。例如，可以對患有局部腦缺血的模式生物制作腦部切片，以了解形態(tài)差異和細(xì)胞數(shù)量。

挑 戰(zhàn)

首要的挑戰(zhàn)之一是使用顯微鏡初步觀察樣本。需要將樣本置于載物臺(tái)上并不斷調(diào)整三維位置以確保對樣本進(jìn)行正確成像。你從目鏡或屏幕上看到的只是樣本極小的一部分。因此，要將樣本保持在正確的焦距內(nèi)并找到正確位置，以便找到感興趣的區(qū)域，是一個(gè)非常麻煩的過程。MICA的樣本查找功能通過將樣本聚焦并生成每個(gè)相關(guān)區(qū)域的低倍率預(yù)覽圖來自動(dòng)化這個(gè)過程，這個(gè)功能可以用于整個(gè)成像過程的定位。

下一個(gè)挑戰(zhàn)是設(shè)置成像參數(shù)，因此可以在看到感興趣的信號(hào)下，避免樣本遭受不必要的光漂白。這一步驟通常要同時(shí)選擇激發(fā)和接受檢測的技術(shù)參數(shù)，因?yàn)槊恳豁?xiàng)參數(shù)都會(huì)對樣本和獲得的結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。使用MICA，您只需輕輕點(diǎn)擊一下“Live”，便可自動(dòng)完成可視化熒光所需的所有參數(shù)設(shè)置?？呻S時(shí)通過點(diǎn)擊“OneTouch”執(zhí)行這一自動(dòng)化設(shè)置來優(yōu)化當(dāng)前視圖的參數(shù)。更改顯微鏡的特定技術(shù)參數(shù)前，實(shí)驗(yàn)人員通常需要了解更改參數(shù)將產(chǎn)生的影響，但在MICA中，設(shè)置是輸出驅(qū)動(dòng)型的，也就是說，可定義所需的輸出，然后自動(dòng)完成對應(yīng)的調(diào)整。

一般而言，第 一步是確定要成像的正確位置。實(shí)驗(yàn)人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數(shù)字顯微鏡可以生成樣本的概覽，這可以提供一些幫助，但實(shí)驗(yàn)人員仍然需要指出圖像中要進(jìn)一步成像的位置。MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低倍或高倍的預(yù)覽，輕松定位感興趣的區(qū)域，并可以使用工具直接在圖像上標(biāo)記出感興趣的樣本區(qū)域。這樣后續(xù)高分辨率圖片就可以保存下來。

高放大倍數(shù)物鏡通常需要使用浸沒式介質(zhì)，最 常見的是水和油。水為水溶液中的成像樣品匹配了最 佳的光學(xué)指數(shù)，而油為包埋的成像樣品匹配了最 佳的光學(xué)指數(shù)。水浸物鏡也可用于固定式樣本，但會(huì)稍微影響成像質(zhì)量。MICA可同時(shí)滿足兩種需求。水鏡還具有全自動(dòng)化操作的額外優(yōu)勢，水的浸入可以自動(dòng)建立并維持。為進(jìn)一步提高光學(xué)質(zhì)量，一些物鏡會(huì)通過校正環(huán)來補(bǔ)償樣本板的厚度。校正環(huán)可手動(dòng)、也可自動(dòng)操作。MICA配置了自動(dòng)校正環(huán)功能，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)優(yōu)化。

相對厚度是組織切片成像的另一大挑戰(zhàn)。厚切片會(huì)形成較多的散射光，干擾所需信號(hào)。THUNDER可減少背景模糊，為組織成像提供了一種寶貴的計(jì)算成像方法。 MICA集THUNDER于一體，可在合理的時(shí)間范圍內(nèi)確定感興趣的區(qū)域。

除了類似于THUNDER的計(jì)算清除方法，共聚焦激光掃描顯微術(shù)(CLSM)等光學(xué)部分也是3D組織玻片成像的一種方法。這種方法中，可獲得性和可用性方面也是挑戰(zhàn)。

除了技術(shù)設(shè)置比較復(fù)雜，共聚焦顯微鏡所需的培訓(xùn)時(shí)間一般也更長。MICA集共聚焦和寬場成像于一體，最 大程度減少了成像參數(shù)設(shè)置，縮短了所需的培訓(xùn)時(shí)間，同時(shí)也降低了操作顯微鏡的技能要求。

另外，共聚焦和寬場成像模式的圖像設(shè)置有相同的外觀和使用感受，因此，用戶無需學(xué)習(xí)兩種系統(tǒng)的操作方法。而且，用戶可隨意在寬場和共聚焦兩種模式間切換而無需在兩種成像系統(tǒng)間轉(zhuǎn)移樣本。

科學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵方面是，改變盡可能少的變量，以確定對樣本和結(jié)果的任何影響。除了保證樣本處理相同外，另一個(gè)方面是針對激發(fā)和接收檢測成像參數(shù)相同。MICA默認(rèn)在不同項(xiàng)目中保持成像參數(shù)不變，用戶僅基于自己的需求進(jìn)行調(diào)整?？筛鶕?jù)參考圖像輕松恢復(fù)成像參數(shù)。

方法

三個(gè)厚度為250μm的小鼠腦部切片包含下述熒光標(biāo)記物：

• 細(xì)胞核（DAPI，品紅色）

• 神經(jīng)元（細(xì)胞質(zhì)GFP，青色）

• 星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP-DsRed，紅色）

將切片固定于載玻片支架中（圖1）并置于載物臺(tái)上進(jìn)行成像。

圖1：用于玻片成像的MICA玻片夾，例如組織切片。

在樣本定義中輸入蓋玻片類型和染料等基本信息。利用這一信息，Sample Finder可以識(shí)別蓋玻片并自動(dòng)生成低倍的預(yù)覽。對整個(gè)蓋玻片的預(yù)覽可以用來識(shí)別三個(gè)組織切片，然后用Navigator工具進(jìn)行標(biāo)記。隨后無需手動(dòng)調(diào)整成像參數(shù)，便可以在20倍寬場模式下對標(biāo)記區(qū)域生成掃描拼接圖像。在這個(gè)放大倍數(shù)和分辨率下，就能在組織切片上識(shí)別出感興趣的區(qū)域，然后用共聚焦顯微鏡成像。此時(shí)，MICA會(huì)在相關(guān)區(qū)域切換為共聚焦模式，記錄高清晰圖像，包括三維立體圖像。定義三維立體圖像時(shí)，可以手動(dòng)或單擊鼠標(biāo)自動(dòng)設(shè)置限制。z Range Finder工具自動(dòng)確定3D圖像掃描開始和結(jié)束部分。

成像后，可借助MICA Learn & Results工具測量樹突棘。為此，使用pixel classifier在疊層投影下識(shí)別棘突。pixel classifier簡單易用且功能強(qiáng)大，用戶只需使用類似于繪畫工具的繪圖工具標(biāo)記對象的示例，在這種情況下為棘突。通過訓(xùn)練模型，更好地再現(xiàn)輸入，然后提供圖像中其他對象的預(yù)覽。經(jīng)過訓(xùn)練后，就可使用模型分析圖像。 

結(jié)果

找到載玻片預(yù)覽上單個(gè)腦部切片，然后使用Magic Wand工具進(jìn)行標(biāo)記以進(jìn)行掃描拼接。Magic Wand自動(dòng)識(shí)別組織切片的邊界并相應(yīng)地定義所需的拼接。

圖2：MICA在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行完整的玻片預(yù)覽（寬場），便于更輕松地定位。借助該信息的信息，可找到大圖掃描拼接的感興趣區(qū)域?？墒褂肕agic Wand工具自動(dòng)化檢測感興趣區(qū)域。

MICA可同時(shí)采集最 多四個(gè)熒光團(tuán)，因此相比基于濾光塊的序列成像的顯微系統(tǒng)，可有效節(jié)約用戶的時(shí)間。在單次掃描拼接中，可找到感興趣區(qū)域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍數(shù)觀察更多的細(xì)節(jié)。

二維圖像需要借助三維數(shù)據(jù)以獲得更詳細(xì)的信息。為此，z界面中定義了三維立體模式。

在CLSM下進(jìn)行立體采集后（120μm厚），可在三維觀察器中可視化數(shù)據(jù)，獲得腦部樣本的更多空間信息。

圖3：三維重構(gòu)CLSM。通過三維采集進(jìn)一步研究組織切片。利用獲得的三維信息，用戶可以更好地了解樣本的空間狀況，例如了解細(xì)胞間的連接。

對于定量來說，可根據(jù)三維采集信息生成最 大投影來測量樣本樹突棘的平均面積。pixel classifier識(shí)別棘突，分析工具則確定面積。得到的數(shù)值可繪制成圖，以可視化數(shù)據(jù)和相關(guān)性。圖4顯示了樹突棘面積的直方圖。這些結(jié)果也可通過箱線圖的形式顯示，來比較不同的樹突棘群落（圖4）。

圖4：分析。MICA不僅采集圖像，還可對它們進(jìn)行分析。

為此，可使用基于人工智能技術(shù)的pixel classifier來識(shí)別相關(guān)的圖像細(xì)節(jié)。隨后，識(shí)別出的對象可以被量化并顯示在圖形中。在本示例中，樹突棘的平均面積在最 大投影上測量。

結(jié)論

MICA是用于三維組織成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用戶可以快速了解樣本的整體質(zhì)量，確定進(jìn)一步的操作。隨后，Navigator視圖可對組織切片進(jìn)行更深入的觀察。Magic Wand等工具用于快速定義感興趣的區(qū)域，加上4個(gè)通道的同時(shí)成像，可加快大圖掃描拼接的速度。使用新的z界面使三維采集更加簡化，pixel classifier能輔助后續(xù)分析。

簡而言之，MICA集寬場成像和共聚焦成像于一個(gè)系統(tǒng)中。它可以幫助用戶在一個(gè)系統(tǒng)中完成從圖像預(yù)覽到三維細(xì)節(jié)成像再到分析的整個(gè)工作流程。

參考資料：

Efficient Long-term Time-lapse Microscopy, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

常規(guī)的組織學(xué)檢查通常使用冷凍或石蠟包埋的樣本切片，微米級(jí)別厚度的組織切片允許對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記及表征，但卻無法探知生物樣本的三維特性。切片分析只對病理樣本的局部進(jìn)行了探測研究，整個(gè)病理組織中，有相當(dāng)大部分的信息仍未被探索。隨著組織透明化技術(shù)的發(fā)展與光片顯微鏡的誕生，我們終于可以對完整樣本進(jìn)行完整的成像表征。最近發(fā)表在Nature Reviews Cancer的一篇綜述中[1]總結(jié)了組織透明化、成像技術(shù)及3D成像的新應(yīng)用等。

組織透明化方法在近十年內(nèi)迅速發(fā)展，各種化合物的聯(lián)合使用已被廣泛用于減少光散射和光吸收，并增加光學(xué)顯微鏡在成像中的成像深度。雖然組織透明化最初由神經(jīng)科學(xué)家用于描繪小鼠中shu和外周的神經(jīng)系統(tǒng)，而近幾年的研究表明，對于組織的三維成像也可助力發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和腫瘤機(jī)理等多種學(xué)科。例如腫瘤研究中，三維熒光成像已被用于評估腫瘤遷移性、腫瘤組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞異質(zhì)性、表征腫瘤微環(huán)境和評估腫瘤模型的ZL反應(yīng)等。

作者首先對各種透明化方法的特點(diǎn)進(jìn)行了比較與介紹，腫瘤因其異質(zhì)性及致密的結(jié)構(gòu)首先需選擇適當(dāng)?shù)耐该骰绞健＝酉聛?，作者介紹了3D成像在腫瘤研究中的應(yīng)用：
1.成像并定量：2D成像無法避免因切片帶來的數(shù)據(jù)缺失，3D成像則可以很直接的進(jìn)行數(shù)據(jù)定量[2]；

2.腫瘤結(jié)構(gòu)：3D成像有助于從細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架等腫瘤模型中進(jìn)行發(fā)生、發(fā)展分析[3]；

3.脈管系統(tǒng)：脈管系統(tǒng)與腫瘤進(jìn)展及侵襲性相關(guān)，3D成像有助于評估抗血管生成的ZL反應(yīng)[4]；

此外，對完整組織的3D成像也有助于對于腫瘤的轉(zhuǎn)移評估、深入探索腫瘤微環(huán)境；腫瘤侵襲、傳播與耐藥性相關(guān)的病理研究；3D組織病理學(xué)研究等。

 
參考文獻(xiàn)：[1] Almagro J, Messal HA, Zaw Thin M, van Rheenen J, Behrens A. Tissue clearing to examine tumour complexity in three dimensions. Nat Rev Cancer. 2021 Jul 30. doi: 10.1038/s41568-021-00382-w. Epub ahead of print. PMID: 34331034.[2] Wei M, Shi L, Shen Y, Zhao Z, Guzman A, Kaufman LJ, Wei L, Min W. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Apr 2;116(14):6608-6617. doi: 10.1073/pnas.1813044116. Epub 2019 Mar 14. PMID: 30872474; PMCID: PMC6452712.[3] Messal HA, Alt S, Ferreira RMM, Gribben C, Wang VM, Cotoi CG, Salbreux G, Behrens A. Tissue curvature and apicobasal mechanical tension imbalance instruct cancer morphogenesis. Nature. 2019 Feb;566(7742):126-130. doi: 10.1038/s41586-019-0891-2. Epub 2019 Jan 30. PMID: 30700911; PMCID: PMC7025886.[4] Dobosz M, Ntziachristos V, Scheuer W, Strobel S. Multispectral fluorescence ultramicroscopy: three-dimensional visualization and automatic quantification of tumor morphology, drug penetration, and antiangiogenic treatment response. Neoplasia. 2014 Jan;16(1):1-13. doi: 10.1593/neo.131848. PMID: 24563615; PMCID: PMC3924547.

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在生物成像和光診療學(xué)領(lǐng)域，通過對材料的結(jié)構(gòu)調(diào)整以控制其光學(xué)性質(zhì)是探索新材料，發(fā)現(xiàn)新應(yīng)用的重要且常見方式。貴金屬就是其中較為主要的一類原料，但通常的貴金屬材料存在兩個(gè)明顯缺點(diǎn)：一、激發(fā)波長通常落在可見光和近紅外一區(qū)（NIR-I，700 – 1000 nm），這使得成像的深度降低，同時(shí)無法與組織發(fā)生明顯的作用；二、該類材料通常不具備激活功能（即始終在線，Always-on），使得難以從成像中分辨目標(biāo)和其他無關(guān)組織，同時(shí)可能會(huì)存在未知副反應(yīng)。

在這樣的背景下，作者Chunyu Zhou等人將目標(biāo)放在更高信噪比、更大成像深度的近紅外二區(qū)（NIR-II，1000 – 1700 nm），開發(fā)能夠?qū)δ[瘤微環(huán)境進(jìn)行響應(yīng)的貴金屬納米材料。該材料以金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）為主體（見圖1），在乙醇和水的混合體系中使其形成納米鏈（Nanochain）。之后引入Tetraethyl orthosilicate，（TEOS），水解后包裹金納米鏈，形成核鞘結(jié)構(gòu)（Core-sheath nanostructure，AuNCs@SiO2）。注射至小鼠體內(nèi)后，因腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）中高H2O2水平觸發(fā)鄰近金納米顆粒在AuNCs@SiO2的有限局部空間內(nèi)融合，從而產(chǎn)生了具有強(qiáng)NIR-II吸收的串狀結(jié)構(gòu)。

圖1：AuNCs@SiO2作用示意圖

因AuNCs@SiO2具有TME激活特性，因此不容易受其他組織的影響，表現(xiàn)出優(yōu)異的光聲成像性能（圖2）。

圖2：正常組織與腫瘤組織的超聲、光聲成像對比

同時(shí)，AuNCs@SiO2在1064 nm處光熱轉(zhuǎn)換效率高達(dá)82.2%（圖3），可導(dǎo)致癌細(xì)胞嚴(yán)重死亡，顯著抑制腫瘤生長（圖4、5、6）。

圖3：AuNCs@SiO2與其他已報(bào)道的光熱治療試劑的轉(zhuǎn)換效率對比：1) AuNCs@SiO2; 2) Au3Cu@PEG TPNCs; 3) Au-wires-on-AuNR; 4) Pt Spiral; 5) Cu2MnS2 NPs; 6) Nb2C (Mxene); 7) Cu3BiS3 NRs; 8) L-Pdots; 9) TBDOPV-DT NPs; 10) SPN-DT

圖4：注射PBS和AuNCs@SiO2的荷4T1瘤小鼠光熱紅外熱成像（1064 nm NIR-II激光，0.5 W/cm2）

圖5：注射PBS和AuNCs@SiO2后，腫瘤部位溫度與照射時(shí)長的變化趨勢

圖6：接受相應(yīng)治療后的小鼠腫瘤大小對比（I：PBS；II：AuNCs@SiO2；III：PBS+Laser；IV：AuNCs@SiO2+Laser）

總結(jié)：作者成功合成出具有TME響應(yīng)的、同時(shí)具有光聲成像和光熱治療功能的二氧化硅包裹自組裝金納米鏈。通過TME中高濃度H2O2水，使金納米粒子表面檸檬酸氧化，進(jìn)而脫離納米粒子表面，導(dǎo)致金納米粒子融合，產(chǎn)生強(qiáng)NIR-II吸收。這一新型材料或許能夠?yàn)闇?zhǔn)確非侵入性診療打開新的大門。

美國PhotoSound 小動(dòng)物3D光聲/熒光成像系統(tǒng) (PAFT)

美國PhotoSound小動(dòng)物全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)(PAFT)為小動(dòng)物活體成像和表征提供了完整的解決方案。該系統(tǒng)集成了三種互補(bǔ)的三維成像模式：光聲成像(PAT)、熒光成像(FMT)、生物發(fā)光成像(BLT)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物的3D光聲、3D熒光和3D生物發(fā)光成像,該系統(tǒng)可為生物組織提供高分辨率、高對比的解剖學(xué)成像效果。

可實(shí)現(xiàn)近紅外一區(qū)和近紅外二區(qū)（670-2600 nm）小鼠全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)，采用OPO可調(diào)式激光器，提供670-2600 nm連續(xù)脈沖激光、完全3D光聲成像(具有100 um等向分辨率的完全三維成像，非切片疊加成像)、高通量 (256個(gè)電子通道)、靈敏度高(60 nM ICG )、桌面式設(shè)計(jì)，方便使用、成像速度快 (完成一次3D掃描需30秒)。

往期回顧

● 美國PhotoSound小動(dòng)物全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)

● 小鼠解剖應(yīng)用筆記 —— 美國PhotoSound小動(dòng)物全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)

● 光聲成像應(yīng)用 | 探尋動(dòng)脈粥樣硬化斑塊

在本文中，我們解釋了現(xiàn)有的3D打印技術(shù)，3D打印的變化和局限性。本文介紹的3D打印技術(shù) 基于相同的加法過程系統(tǒng)，每個(gè)對象通過信息系統(tǒng)切成薄片然后再逐層構(gòu)建。

微流控3D打印機(jī)的類型

微流體3D打印機(jī)：科學(xué)應(yīng)用
3D打印是一種古老的工廠工藝，是增材制造的一種傾斜。隨著效率的提高，3D打印在許多不同的領(lǐng)域中找到了應(yīng)用，例如微流控技術(shù)。3D打印技術(shù)允許使用多種材料以廉價(jià)的成本開發(fā)出任何一次性物品。3D打印的準(zhǔn)確性已經(jīng)非常高了，足可以創(chuàng)建微流體系統(tǒng)，并且現(xiàn)今的市場上已經(jīng)存在這種3D打印機(jī)。

微流體3D打印機(jī)：選擇性激光熔化（SLM）
這里，激光束在整個(gè)打印方案中移動(dòng)并加熱粉末狀材料，直到材料的熔點(diǎn)，粉末變成固化的結(jié)構(gòu)。一旦完成該步驟，輥?zhàn)泳蜁?huì)將粉末放在已向下移動(dòng)一層高度的工件上方，然后再次開始激光燒結(jié)過程。
選擇性激光熔化更多地用于金屬成分。

微流體3D打印機(jī)：選擇性激光燒結(jié)（SLS）
選擇性激光燒結(jié)就像SLM一樣，但有一個(gè)區(qū)別：激光束不會(huì)在材料的熔點(diǎn)加熱，它會(huì)在材料熔點(diǎn)之前停止加熱，并在粉狀材料的晶粒之間產(chǎn)生內(nèi)聚力，因此，熱量會(huì)重新組合粉末材料之間的晶粒并產(chǎn)生內(nèi)聚力。
選擇性激光燒結(jié)更多地應(yīng)用于熱塑性組合物。

微流體3D打印機(jī)：熔融沉積建模（FDM）
熔融沉積建模是世界上常用的3D打印過程，簡單GX。它適用于許多應(yīng)用領(lǐng)域。熔融沉積建模的原理是放下加熱的塑料，將加熱框架放在平坦的表面上（對應(yīng)于X和Y的移動(dòng)），然后逐片向上移動(dòng)（在Z軸上移動(dòng)）。所有這些移動(dòng)都描述了該空間的3軸即笛卡爾空間。

微流體3D打印機(jī)：立體光刻設(shè)備（SLA）
立體光刻設(shè)備具有與選擇性激光熔化和選擇性激光燒結(jié)相同的過程，激光束以曝光參數(shù)加熱樹脂，并使樹脂聚合。物體再次移動(dòng)一層的高度，然后機(jī)器根據(jù)物體的切片投影一個(gè)新方案。產(chǎn)品受紫外線輻射以使其固化。

由于我們正在開發(fā)FDM 3D打印機(jī)，因此，本文的以下部分將僅涉及FDM技術(shù)。

微流體3D打印機(jī)：熔融沉積模型打印機(jī)的材料種類繁多
與您在市場上找到的各種絲狀材料（ABS、PLA、POM、尼龍等）相比，樹脂的多樣性受到限制。材料的類型有很多種：可生物降解、食品接觸證明、耐腐蝕等，每種材料都有其自身的特征和功能。每種材料都常見的一件事是它們在冷卻時(shí)會(huì)翹曲，某些材料如ABS如果冷卻得太快則會(huì)發(fā)生高翹曲，而PLA則很少出現(xiàn)這樣的問題。翹曲特性取決于材料工廠的每種材料成分和建議。

微流體3D打印機(jī)：3D打印機(jī)移動(dòng)的不同系統(tǒng)和不同精度
對于FDM方法，我們必須將電動(dòng)機(jī)的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換為平移運(yùn)動(dòng)，為此，有2種的解決方案：

（1）帶輪和皮帶系統(tǒng)提供了一種廉價(jià)的解決方案，盡管分辨率降低了精度，但仍可以進(jìn)行高速打印。

（2）螺絲系統(tǒng)：高精度的絲杠和螺母系統(tǒng) – 但是，定位時(shí)會(huì)產(chǎn)生間隙，因此會(huì)降低一點(diǎn)精度。
 

（3）滾珠絲杠系統(tǒng)具有更高的精度，但大大降低了打印速度，但是與其他具有極小的反沖（50μm以下）系統(tǒng)相比，其精度更高，這種系統(tǒng)對于微流體和微系統(tǒng)的加工會(huì)更有吸引力。
 

您可以根據(jù)Z后產(chǎn)品所需的質(zhì)量選擇合適的系統(tǒng)。一些打印機(jī)結(jié)合了用于X和Y軸的螺栓皮帶和用于Z軸的滾珠絲杠。

微流體3D打印機(jī)：熱頭端和熱床（專為FDM打印機(jī)）
熱頭很重要，這是3D打印機(jī)的重要組件。熱頭是在合適的熔融溫度下加熱塑料，然后再沉積。擠出機(jī)的選擇是提高機(jī)器效率的關(guān)鍵。同樣，也有2種擠出機(jī)系統(tǒng)：一種是帶有螺紋噴嘴和水龍頭散熱器，另一種是帶孔噴嘴和散熱器的系統(tǒng)。后面一個(gè)系統(tǒng)會(huì)更有效地防止泄露。

如果材料加熱過多，那么將會(huì)得到粘稠的材料，其會(huì)泄露并擠壓擠出機(jī)。如果材料加熱不足，則長絲狀材料將無法通過噴嘴。

熱珠可較大程度地減少熱端和環(huán)境之間的溫度差，因此，它可以防止加熱的材料獲得過高的冷卻速率并自行回縮以產(chǎn)生稱為翹曲的現(xiàn)象。加熱塑料可使其保持在不會(huì)變形的溫度范圍內(nèi)。

微流體3D打印機(jī)：軟件 – 3D打印機(jī)的計(jì)算機(jī)界面
微流體3D打印機(jī)軟件通常分為兩部分：diyi部分允許您將對象放置在板上并選擇不同的參數(shù)如高度、填充、速度、圖形界面等；第二部分“hide”是切片機(jī)，該部分會(huì)對在您選擇的不同參數(shù)的任何切片高度上進(jìn)行切割，切片器將會(huì)創(chuàng)建100個(gè)切片。在每個(gè)切片中，它將分析“圖像”并分解為坐標(biāo)以及X軸和Y軸，因此，這是我們通過告訴電機(jī)將位置從另一個(gè)位置移動(dòng)來創(chuàng)建移動(dòng)的方式。這些指示在名為“gcode”的文件中列出，這也是您文件的擴(kuò)展名，例如：

G1 : Telling the printer to move                   F: for feedrate in mm/min

提高3D打印機(jī)精度的機(jī)械元件：步進(jìn)電機(jī)

步進(jìn)電機(jī)的旋轉(zhuǎn)是逐段地旋轉(zhuǎn)的，例如1.8°/step的電動(dòng)機(jī)需要200步（step）才能旋轉(zhuǎn)200×1.8°=360°，角度越小，獲得的精度就越高。電機(jī)還必須與系統(tǒng)耦合才能實(shí)現(xiàn)平移運(yùn)動(dòng)，并與步進(jìn)驅(qū)動(dòng)器耦合。這個(gè)全局系統(tǒng)將定義移動(dòng)給定距離所需要的步驟。但是，每步的度數(shù)越小，您的全局系統(tǒng)將越精確：如果需要80步長移動(dòng)1mm，那么1步長移動(dòng)1/80=0.125mm或12.5μm，而如果需要320步長移動(dòng)1毫米，通過相同的計(jì)算，則1步長移動(dòng)3.13μm，這種精度是微流體系統(tǒng)必需的。

步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器：提高精度的電子元件

步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器通過內(nèi)插電動(dòng)機(jī)的當(dāng)前功能并將其分段，從而提供虛擬步長和電子精度。這些虛擬步長乘以系統(tǒng)的機(jī)械步長，但是虛擬步長越高，扭矩越低。因此，需要在虛擬步長和扭矩之間做一個(gè)折衷。步進(jìn)驅(qū)動(dòng)器也可以控制電機(jī)的噪音。

風(fēng)扇：對獲得更好的3D打印效果很重要

通常，一是通過冷卻擠出機(jī)的散熱器主體，以防止溫度過高；二是在需要時(shí)冷卻部分（像橋接結(jié)構(gòu)一樣，建議使用高冷卻的方式）。

用戶操作的3D打印機(jī)界面

打印機(jī)界面可以使機(jī)器運(yùn)行、自動(dòng)化控制且易于使用。配備SD插槽后，您可以使用簡單操作的界面運(yùn)行任何已加載的程序，甚至可以在需要時(shí)調(diào)整某些參數(shù)。

電子電容傳感器

這種電容式傳感器可以做有趣的事，首先，它為diyi層提供了良好的擠出機(jī)高度，并允許測試平坦表面的不同點(diǎn)且創(chuàng)建表面的虛擬法線向量，并將每個(gè)點(diǎn)乘以該法線以便在移動(dòng)和定位時(shí)獲得更好的精度！