參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(2條)

• 

  xinxmv0119 2016-05-31 00:00:00

  溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。Z后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多溴化乙錠，直至達(dá)到飽和( 每2個堿基對大約結(jié)合1個溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的shou選方法。然而該過程既昂貴又費(fèi)時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中Z好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級沉淀法。 從大腸桿菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其分離的依據(jù)可利用分子大小不同，堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來進(jìn)行。堿基性法抽提效果良好，既經(jīng)濟(jì)且得率較高。抽提到的質(zhì)量DNA可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化。對于分子量較大拷貝較少對的質(zhì)粒DNA，由于DNA片段較大易于損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，且具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定且獲得的質(zhì)量DNA是超螺旋構(gòu)型等特點(diǎn)。對于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，用少量制備法抽提質(zhì)粒DNA就有足夠量可用于基因操作。 Z近已得到改進(jìn)（R.Treisman，個人通訊）并達(dá)到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質(zhì)粒。聚乙二醇分級沉淀法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點(diǎn)不同，那就是不能有效地把帶切口的環(huán)狀分子同閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開，因此， 純化容易帶上切口的極大質(zhì)粒（大于15kb）。用于生物物理學(xué)測定的閉環(huán)質(zhì)粒時，平衡離心仍是shou選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足以勝任分子克隆中各種復(fù)雜工作的質(zhì)粒DNA，包括用于哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及利用外切核酸酶產(chǎn)生成套的缺失突變體。 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA。

  贊(15)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論

• 

  z20112012321 2016-08-02 00:00:00

  質(zhì)粒DNA純化的試驗(yàn)原理：溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。Z后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多溴化乙錠，直至達(dá)到飽和( 每2個堿基對大約結(jié)合1個溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的shou選方法。然而該過程既昂貴又費(fèi)時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中Z好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級沉淀法。從大腸桿菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其分離的依據(jù)可利用分子大小不同，堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來進(jìn)行。堿基性法抽提效果良好，既經(jīng)濟(jì)且得率較高。抽提到的質(zhì)量DNA可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化。對于分子量較大拷貝較少對的質(zhì)粒DNA，由于DNA片段較大易于損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，且具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定且獲得的質(zhì)量DNA是超螺旋構(gòu)型等特點(diǎn)。對于高拷貝數(shù)質(zhì)粒，用少量制備法抽提質(zhì)粒DNA就有足夠量可用于基因操作。 質(zhì)粒DNA純化的試驗(yàn)步驟：測量DNA溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl， 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應(yīng)為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml?！句寤义V貯存液應(yīng)貯存于避光容器內(nèi)（如用錫箔完全包裹的瓶子），于室溫保存。室溫下用Sorvall SS34頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以8000rpm離心5min， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細(xì)菌蛋白所形成的復(fù)合物。用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。以20℃對所得的密度梯度以45 000rpm離心16h（VTi65 轉(zhuǎn)頭）、 以45 000rpm離心48h（Ti50轉(zhuǎn)頭）、以60 000rpm離心24h（Ti65轉(zhuǎn)頭）或者以60 000rpm離心24h（Ti70.1轉(zhuǎn)頭）。普通光照下，在梯ZX可見兩條DNA區(qū)帶， 上部區(qū)帶材料通常較少，由線狀的細(xì)菌（染色體）DNA和帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA組成：下部區(qū)帶則由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠RNA復(fù)合物，位于CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質(zhì)。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環(huán)質(zhì)粒DNA而不至超負(fù)荷。如有更大量的質(zhì)粒存在，將擴(kuò)展為一條寬帶，并與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質(zhì)粒復(fù)制達(dá)到極高水平時才會出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現(xiàn)負(fù)荷，可收集整個DNA區(qū)高產(chǎn)水平時才會出現(xiàn)，只要將該質(zhì)粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現(xiàn)超負(fù)荷，可收集整個DNA區(qū)帶，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）將體積調(diào)到15ml，在兩個離心管中再度離心，使DNA達(dá)到平衡。收集DNA帶。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進(jìn)入，為盡量減少污染的機(jī)會，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區(qū)帶（雜色體DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后將一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體DNA區(qū)帶之下并與該區(qū)帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內(nèi)，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端并將第2根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號），將下部的質(zhì)粒DNA區(qū)帶收集到玻璃或塑料管中。

  贊(12)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論