在決定實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確性和可靠性的眾多因素中，模板質(zhì)量是決定重復(fù)性和生物學(xué)相關(guān)性的重要因素之一。諸多報(bào)告中也描述了生物樣品中常見(jiàn)的YZ成分會(huì)導(dǎo)致qPCR分析靈敏度和動(dòng)力學(xué)的顯著降低。

如何檢測(cè)YZ劑：

多種方法可用于評(píng)估生物樣品中是否存在YZ劑。常用方法是通過(guò)連續(xù)稀釋樣品來(lái)評(píng)估樣品的PCR效率，PCR效率的高低一定程度上反映出樣品質(zhì)量的好壞。一個(gè)GX的PCR反應(yīng)要求擴(kuò)增效率在90%-110%之間，當(dāng)擴(kuò)增效率＞110%或＜90%，無(wú)論是相對(duì)定量還是JD定量其ZZ結(jié)果都會(huì)不準(zhǔn)確。那么怎么來(lái)判斷是由于YZ劑引起的擴(kuò)增效率異常呢？如圖1所示，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的狀態(tài)判斷，當(dāng)原液的數(shù)據(jù)點(diǎn)位于標(biāo)曲上方（紅色箭頭），則極有可能是樣本YZ劑YZPCR反應(yīng)導(dǎo)致Cq值偏大。

內(nèi)部擴(kuò)增控制（IACs）是一種與目標(biāo)核酸共純化和共擴(kuò)增的方法，可用來(lái)檢測(cè)YZ劑和指示加工過(guò)程中的模板丟失。IACs可包裝在噬菌體外殼中，也可以是包含引物結(jié)合序列和探針檢測(cè)序列的單鏈寡核苷酸。在熒光信號(hào)采集過(guò)程中，探針結(jié)合位點(diǎn)的部分不匹配阻止了與IACs雜交，隨后可對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析，用以區(qū)分IACs和目標(biāo)擴(kuò)增子。IACs將是檢測(cè)病原體的優(yōu)質(zhì)方案，但這種方法不適用于細(xì)胞mRNA定量，因?yàn)榭紤]為每個(gè)單一mRNA設(shè)計(jì)模擬物是不現(xiàn)實(shí)的。

另外，也可以通過(guò)使用外源性對(duì)照來(lái)測(cè)試YZ劑，也稱(chēng)為Spikes。該方法無(wú)論是在其構(gòu)造技術(shù)的復(fù)雜性方面，還是在分析之后與它們的準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)的額外工作方面，相對(duì)都是比較簡(jiǎn)單的。Spikes可以是RNA也可以是DNA分子，這取決于靶標(biāo)類(lèi)型。mRNA表達(dá)分析選RNA Spikes，DNA靶標(biāo)分析選DNA Spikes。Spikes通常是幾千個(gè)堿基/堿基對(duì)異型序列，所以不會(huì)與任何已知目標(biāo)交叉反應(yīng)。

YZ劑類(lèi)型：

YZ劑可以是核酸提取過(guò)程中使用的試劑，也可以是從生物樣品中提取的成分。YZ劑的影響，較好的情況是YZ劑會(huì)產(chǎn)生不準(zhǔn)確的定量結(jié)果；最壞的情況是高度YZ會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。常見(jiàn)的YZ劑類(lèi)型如下：

1）樣品本身的成分：許多生物樣品本身就含有嚴(yán)重YZ逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的成分，如血液中的血紅蛋白、免疫球蛋白G，肌肉中的肌紅蛋白、膽鹽、腐殖酸、尿素和膠原蛋白，植物中的多糖多酚等。

2）提取和純化試劑的成分：許多用于純化核酸的試劑，如苯酚、氯仿、硫氰酸胍、鹽酸胍、乙二胺四乙酸、二甲基亞砜、十二烷基硫酸鈉、噻唑、三唑和核糖核酸等。

如何降低YZ劑的影響：

當(dāng)樣本中存在YZ劑，高濃度模板中YZ劑濃度較高，對(duì)PCR反應(yīng)的影響較大。低濃度模板由于稀釋使得YZ劑濃度有所下降，YZ劑的YZ作用也相應(yīng)降低。如果是樣品本身的成分，可對(duì)模板進(jìn)行稀釋?zhuān)蛘哌M(jìn)一步純化，又或者改進(jìn)提取方法來(lái)降低YZ劑的干擾。如果提取和純化試劑的成分，其本身就是最有效的逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)的YZ劑，因此需要在提取和純化過(guò)程中注意對(duì)試劑成分的去除，F(xiàn)Z污染模板。

Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Azure Cielo? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來(lái)自美國(guó)Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測(cè)通道，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。這款產(chǎn)品采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強(qiáng)度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；ZY的CMOS拍照+光纖信號(hào)傳輸作為檢測(cè)系統(tǒng)，CMOS檢測(cè)靈敏度高，光纖傳輸速度快，無(wú)光損失和噪音干擾，無(wú)需ROX校準(zhǔn)。Azure Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學(xué)研究提供高JZ度、高靈敏度和高可靠性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

?   數(shù)據(jù)可靠性：連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致。

?  應(yīng)用靈活性：提供多種qPCR應(yīng)用分析。

?   流程智能化：中英文用戶(hù)界面，觸控操作，可多機(jī)聯(lián)用。

?   在線便捷性：主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，數(shù)據(jù)可USB、Wi-Fi等網(wǎng)絡(luò)傳輸。