參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(3條)

• 

  微影中心1 2010-05-31 00:00:00

  Trizol，CTAB，SDS，異硫氰酸胍法等等 Tizol在一般的物種都挺好用！當(dāng)然要看你的材料是什么了。植物的次代謝產(chǎn)物多，目前常用的是CTAB法。 具體方法就太多了，針對不同試驗(yàn)材料的各自特點(diǎn)，將幾種大的方法略加改動。

  贊(20)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論

• 

  影云淡風(fēng)輕 2010-06-02 00:00:00

  主要有苯酚、異硫氰酸胍、CTAB、LiCl密度梯度、Trizol等方法。 現(xiàn)在常用的是Trizol法。 提前將研缽、研棒、剪刀、鑷子等用錫箔紙包好200度烘烤6小時(shí)，與實(shí)驗(yàn)前放到冰箱中預(yù)冷。槍頭、離心管等DEPC水浸泡處理12小時(shí)后，高溫滅菌30分鐘（也可不用DEPC處理，常規(guī)高溫滅菌40分鐘），整個(gè)處理過程必須帶手套（Z好帶口罩），否則環(huán)境中的RNA酶會降解RNA。 1、取鮮樣或者在-80度保存樣品，液氮研磨樣品至細(xì)小粉末，0.1g樣品加入1mlTrizol混勻，室溫靜置5分鐘。 2、12000rpm離心十分鐘，取上清至一新的離心管中，加入0.2ml氯仿劇烈晃動15秒，室溫靜置2-3分鐘 3、12000rpm離心十分鐘，取上清至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘 4、12000rpm離心十分鐘，去除上清，用70%乙醇清洗2次，7500rpm離心五分鐘，晾干。（不可過分干燥否則不易溶解） 5、加入適量DEPC水溶解沉淀

  贊(13)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論

• 

  go小飛454 2010-06-02 00:00:00

  通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，Z后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時(shí)可能將RNA降解，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。 0 T3 z( F& _， D6 c% ^" h6 Y A6 _RNA提取的一般步驟 - O: Y+ x$ p# s8 U4 M9 S 所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效YZ；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中Z關(guān)鍵的是YZRNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。diyi種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。( O( g; ^+ K) f+ i& ]% P 實(shí)驗(yàn)步驟： * l& d6 s5 e( q1 F( g2 | j， ^0 s 破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。6 D8 }. Q; Y， g* X 1、 破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以YZRNA酶活性。 " s% f， `0 [1 d* m! ]0 e2、 分離RNA一般用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。 & X. P) i) Y; L# u/ [3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。2 @0 d& z7 ?+ i， g1 @ 4、 洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。 3 @% V" o9 v+ I1 J2 o9 k" z5、 融解RNA一般使用TE。 ; L5 f. n6 }( S1 t% Z& J6、 保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12，000×g離心5分鐘。 & P3 [7 m* ^$ U$ _" ? : F" x u* N( ?( I氯化鋰法提取總RNA： " u; }' I! r' ^' ^& l 本方法用高濃度尿素變性蛋白并YZRNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。# ~* S: }9 `* r4 Z3 P 試驗(yàn)試劑： " d$ r6 Q+ _. I8 Q1、 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】 7 _8 w1 t" o9 a' q! i4 Z2、 懸浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ，1mM? EDTA (pH8，0) ，0.5%SDS】 ! m8 Q4 R， ]& y: b# `7 d試驗(yàn)步驟：7 [6 ?$ `* }; o7 _ Z' { 1、 對于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。& Y) b: E， Q" l/ ^ Q: \$ s 2、 勻槳液在0－4℃放置4小時(shí)后，12000g離心30分鐘。 x- C6 D- N/ N0 K! t2 a 3、 取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2。 ) y- x) S0 K9 y6 j， e4、 沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時(shí)搖動混勻，4000g離心5分鐘。 3 d2 v' i1 ~( ~* D5、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時(shí)，5000g離心。 L4 a' Q4 u" l: a* K% Z$ ?( e6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3 }; r0 [/ Q' G9 q 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 0 f. X% R( H% B7 g ! y7 j5 u$ C' |) [% ~! J3 D: Q蛋白酶－熱酚法6 |" ^0 b* [) P3 S* c4 b4 H4 l 本方法適合于病毒RNA的提取 * I( i+ b# r! K試驗(yàn)試劑： $ ?4 [7 H9 `) J1、 蛋白酶K（終濃度50ug/ml）， J5 p l6 V/ t7 [/ I 2、 2×緩沖液：1%SDS? 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL9 h， p ] y+ \$ Z) O 試驗(yàn)步驟：# W3 v8 G1 [$ ]5 y 1、 提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K，37℃40-50分鐘。 - K0 p/ E' G0 M# Q- z7 n， {# d2、 加入等體積65℃預(yù)熱的酚溶液，輕徭，在65℃保溫5分鐘后再輕徭。 w! `; W( ~， E: i3 ^3、 離心，取上清，氯仿抽提一次。， |( Z0 d; j2 @7 m+ d2 Q& x H 4、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時(shí)，5000g離心(10000g，10min)。 7 [/ w， h2 d6 U$ k5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 % A5 Y; {( w% ]3 a* y， O e) P6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相應(yīng)對策 植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相應(yīng)對策 ) o5 B7 d/ Q3 _酚類化合物的干擾及對策： a9 D* Z3 K ?7 W 許多植物組織特別是植物的果實(shí)（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開。9 b0 S! }0 U6 |9 k/ l! v" v g1 ~/ @ 防止酚類化合物被氧化的方法： " v; y， a4 k7 n/ Z1、 還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質(zhì)被氧化，有時(shí)提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達(dá)2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認(rèn)為在過夜沉淀RNA時(shí)加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。 & H. z. p+ ~& t% t5 G& G1 M- P/ q! u2、 螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多酚的能力會迅速降低〔11〕。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時(shí)，單獨(dú)使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。 p% N0 w/ t7 r3、 Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復(fù)合物，從而YZ了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率。 # p8 ]0 ^8 K3 a4、 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)會，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時(shí)要加入肝素以YZRNase的活性。) ~# H/ y( P7 Q) j4 G* w1 G8 l 5、 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。 @+ ?- X/ V9 z8 T8 H: B3 C! W' C 酚類化合物的去除 ： & z# h) G0 H& ]$ I1 N" f. l9 N 通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。5 C6 Y8 a1 S V: `2 ~ 多糖的干擾及對策：6 I- b3 R4 ~$ T& O 多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以YZ許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問題。 7 [' X/ e， d8 x( B- p( |9 C& n 用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉淀多糖的，進(jìn)一步純化了RNA樣品。 ! i5 b5 m* z9 G8 M4 ~- N/ D 另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時(shí)，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結(jié)合使用效果Z佳。 6 c9 |5 q1 b9 [5 l1 s+ n Fang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹RNA時(shí)，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM，然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖。3 B1 h# M' {+ {0 U% U， K2 @， v
  蛋白雜質(zhì)的影響及對策：$ @- G5 o( f1 s9 _2 V* G2 n/ ^
  蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以YZRNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。' T7 v( F1 J9 @+ E
  Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時(shí)RNA能沉淀下來而能溶于70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。
  3 q e/ \* I" A& @次級代謝產(chǎn)物的影響及對策：: N3 |) N f K# n; p' f6 h0 J2 A0 {
  從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒有什么特殊的方法來解決這個(gè)問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。( M s5 O% f! H- Q* \( m" `( } 由于植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。實(shí)踐中經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對于某一植物或其組織來說，其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過摸索和實(shí)踐才能確立。# S0 a# G7 L3 S& A 隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎(chǔ)的植物材料RNA提取過程中還會出現(xiàn)新的難點(diǎn)，但隨著不斷地探索和經(jīng)驗(yàn)的積累，科學(xué)工作者們一定會迅速地解決這些難點(diǎn)，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法 植物RNA提取中的一些特殊方法 $ e* [2 U( E% h' [多酚類植物的RNA提?。? j! d， ]2 V( R! B& o 蘋果棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。這個(gè)方法是驗(yàn)證過有效的，提取的RNA純度不是特別高，但是用作northern足夠。6 j& d2 u( \6 W8 _& o4 E1 X1 t 實(shí)驗(yàn)試劑： # s7 s8 H! R# W1 y# g提取buffer 200ml：NaCl 1.1688g 100mM Tris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0) EDTA 5.8450g 10mM SDS 2.0000g 1% NaOH調(diào)至8.0，定至200ml，加200ulDEPC融解.* j) s; t2 @) t4 W' F 試驗(yàn)步驟： ! T a0 I* C( w5 S" E* A' W1、 1.5ml離心管用液N2冷凍吼加入0.1g樣品，立即加入500ul酚氯仿，再加入500ul提取buffer，劇烈振蕩1-2min，冰上放置5min。" F3 S0 V5 @0 s7 i1 T 2、 4度12000rpm離心15min， 上清轉(zhuǎn)入新管，加氯仿異戊醇抽提一次。) H' L7 d# d" y8 @ 3、 取600ul異丙醇，-20度沉淀20min. & w: m2 r: I4 \4 l# J4、 12000rpm離心10min。 ! I. Y. \8 b7 A5、 沉淀用70度乙醇洗。 k! T. D1 [0 w+ ?) _0 D5 ?6、 8000rpm 5min。 " A; y# }' F( `5 }6 I+ N! x7、 沉淀晾干，溶于30ulDEPC水。; ^0 Q- R+ `5 j( n' [' m9 M # m/ r3 o2 O! T6 z$ `1 m& e. ^ 銀杏等木本裸子植物的RNA提取方法：& A i& V! H0 ` ?6 R 銀杏、香機(jī)等木本裸子植物，酚類和多糖等次生物質(zhì)含量較多，對RNA的分離和純化有很大干擾，嚴(yán)重影響了提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，給相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行帶來阻礙。目前，RNA的提取方法很多，采取常規(guī)的Trizol試劑盒、SDS等方法不能提取銀杏RNA，而Shujun Chang等(1993)的CTAB法，提取RNA質(zhì)量也較差，降解也十分嚴(yán)重。對其提取步驟進(jìn)行改進(jìn)，得到質(zhì)量較高的銀杏RNA樣品。/ s4 i* V k8 S) x 試驗(yàn)試劑：! ]! M( q# E7 N3 t; `# i. m( [ 1、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用濃鹽酸調(diào)至Ph8 .0，定容至lOO mL.用滅菌的DEPC水溶解。 `4 c9 {) p2 \4 t2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O加入80m L水中，攪拌溶解，用NaOH調(diào)pH至8.0，定容至100mL。; V# x* j! H4 y! G4 M# q3 c5 P 3、 10 mol/LLiCL: 42.4 gLiCL， 100mL水溶解即可。9 i) @ a' \& w+ c p* g 4、 提取緩沖液(DEPC水處理):2% CTAB（蛋白質(zhì)變性劑）.2% PVPK 30（去除多酚類物質(zhì)）10 0m M Tris-HCL (Ph8.0)25 m M EDTA（金屬鰲合劑）2.0 M NaCL（去除多糖和CTAB）配法:2 g CTAB， 2 g PVP， 10 mL 1 mol/L tris， 5mL 500 mM EDTA， 11.7gNaCL，定容到100mL。) o+ \5 E! X; O# A( M+ P8 H* K9 n0 q 5、 亞精胺(提取時(shí)加少量)（RNA酶YZ劑） # J9 g6 O/ h( u' d6、 4%0一疏基乙醇(提取時(shí)加)（去除多酚類物質(zhì)）' D e， d( J. K$ z! O9 f 7、 氯仿異戊醇(24: 1)（抽提蛋白質(zhì)）) U) A+ ]4 \# Q 8、 10 MLiCL（沉淀大分子RNA） 7 M+ b) g4 J4 m5 C0 f- \9、 SSTE（溶解RNA）1.0 M NaCL 0. 5%SDS 1m MEDTA(PH8.0) 10 m MTrisHCL(pH8 ）配法:2.9 g NaCL， 0.25 g SDS， 0.5 mL 1 M tris， 100 u L 500 mM EDTA， pH8.0，定容至50 mL。. m5 z+ J3 X0 V& \6 e7 Y# R 試驗(yàn)準(zhǔn)備：; _5 z9 }" f% q6 t 1、 研缽和玻璃器皿用錫紙包好，200℃以上向溫烘烤2小時(shí)以上，或180*C 高溫烘烤4小時(shí)。; X7 n3 w， W2 }9 M 2、 塑料制品(槍頭和離心管)Z好用新的，并且用報(bào)紙包好，121'C高壓滅菌，滅菌40 min，或連續(xù)兩次121'C高壓滅菌，每次滅菌20 min，然后用烘箱烘千。 ; X* f+ ~， v7 }. a3、 所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPC uJ濃度為0.1%， 37℃過夜，1211C高壓滅菌40 min.(其中Tris因?yàn)椴荒苡肈EPC處理，所以Tris用DEPC處理的水溶液滅菌后配制。) ) x& B， {% e" ^& F: s0 q試驗(yàn)步驟：" Y6 U+ `2 C* \4 X2 a# r 【根據(jù)文獻(xiàn)(Shujun Chang， 1993) CTAB法，稍作改進(jìn)?！? ; F ^+ e9 I# h/ Q7 m* A* ]1、 將4mL提取液加入到lOmL離心管c卜650C水域加熱。$ D+ ?4 w7 \3 J: w， M 2、 用液氮冷卻研缽，在研缽中加入少量的抗氧化劑PVP，取1g低溫冷凍的銀杏葉片，迅速置于研缽中，不時(shí)加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨后，立即加入到預(yù)熱好的提取緩沖液中，用手搖功混勻。6 C4 i+ L/ Z* C5 G) v 3、 65℃，水域1 min后冷卻至室溫。 ( N2 @) U: S， {9 M" e8 f4、 加入等體積(4mL)的氯仿:異戊X17 (2=L: 1)，混勻，10000rpm， 40C，離心10 min。
  ( H6 P o1 y8 p# ?5、 小心吸取上清液，加入等體積(4mL)的仿:異戊醇(24: 1)，混勻，10000rpm， 40C，離心10 min。. {# k/ z5 r: x: v1 x
  6、 吸取上清液，加1/4體積的IOMLiCL，混合，4℃沉淀過夜，然后10000rpm離心20 min。
  7 x P4 o6 z1 D! [8 }7、 用槍吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，轉(zhuǎn)到1.5m L離心管.加等體積氯仿:異戊醇混勻，10000rpm， 40C，離心10 min。 ， H2 b7 C1 d* [6 r4 c8、 離心吸取取上清液，加兩倍體積的無水乙醉，-70℃沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。" W* c' Y1 P- t5 K) ^， ` 9、 12000rpm， 40C，離心20 min，去上請用70%的乙醇洗兩次，吹干沉淀。1 x， S* X0 V" y6 F/ l 10、 用40 u LDEPC處理的水溶解沉淀，得到RNA樣品。8 f2 C- S4 R3 O9 R4 T e& { 11、 除用于電泳和紫外檢測外，其余RNA-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩? Q0 o7 V. ]9 x， {1 i: _ _ ! U* X1 m5 G9 A( W% U改良Krapp提取法： 1 r) r# s3 ~ |. q1 v. w試驗(yàn)試劑： ' C7 Z1 ^) J5 A& f& W( K d1、 RNA抽提掖：母液：4mol 異硫氰酸胍 20mmol EDTA 20mmol MES pH 7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME貯存在4℃條件下備用。/ a. I$ E. R S% z 2、 RNA重懸液：2mol LiCl 10mmol NaAc調(diào)整終體積為250ml，pH 5.2，滅菌后貯存在4℃條件下備用。2 u; J1 S9 V8 a. j 試驗(yàn)步驟： ) O/ o， L# q- D8 v) U1、 取新鮮植物材料0.5~1g，冷凍干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混勻。7 n Q: B" S N9 B! J$ u 2、 4℃條件下8000rpm離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的酚/氯仿抽提掖，在4℃條件下8000rpm離心10min。 1 N: K+ ]3 R" a7 `3、 上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混勻后，在4℃條件下8000rpm離心10min.）。 $ p+ y， P/ ^- w/ E' g" k0 y: [4、 小心將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷無水乙醇，在-80℃條件下沉淀2小時(shí)。: t& M8 O1 O! C- w5 a 5、 在4℃條件下8500rpm離心30min.，小心棄去上清液，沉淀重懸于RNA重懸液中，置于4℃條件下1小時(shí)。9 b7 Z# K4 v( y% l8 Q0 a8 N) I% | 6、 4℃條件下8500rpm離心10min.，棄去上清液，沉淀溶于適當(dāng)體積的DEOC處理水中。檢測后分裝，置于-70℃條件下保存。

  贊(18)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論