目標(biāo)：

針對(duì)客戶(hù)反饋的工業(yè)顯微鏡相機(jī)拍攝的液滴產(chǎn)生照片中FluoSurf表面活性劑無(wú)法產(chǎn)生液滴小球而進(jìn)行復(fù)現(xiàn)測(cè)試

測(cè)試條件：
1）高精密壓力流量控制器OB1 MK4（量程范圍：0到2000mbar），以快速、無(wú)脈沖的壓力形式驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)；

2）科式流量計(jì)BFS1+，用于監(jiān)測(cè)和控制油相液體的流速；

3）數(shù)字流量傳感器MFS2，用于監(jiān)測(cè)和控制多相水相液體的流速；

4）COC液滴芯片

5）倒置光學(xué)顯微鏡

6）64孔板，未做任何清洗，用于液滴小球的觀察；2mL的EP管，未做任何清洗，用于液體小球的收集；

7）FluoSurf 2wt%表面活性劑（已過(guò)期）和多相水相液體。

注：客戶(hù)使用未過(guò)期的FluoSurf表面活性劑產(chǎn)生液滴小球。

測(cè)試過(guò)程：

1）在恒定壓力下，把油相和水相注入到COC芯片通道內(nèi)。

2）在OB1 MK4設(shè)備的操作軟件ESI上設(shè)置閉環(huán)流量控制，實(shí)現(xiàn)油相和水相液體以恒定、無(wú)脈沖的流速注入到芯片入口。

3）倒置光學(xué)顯微鏡上的目鏡和配套軟件觀察芯片中的液滴產(chǎn)生。

測(cè)試結(jié)果：

FluoSurf 2wt%（已過(guò)期）表面活性劑在COC芯片中可以產(chǎn)生穩(wěn)定、均勻的液滴小球。

高性能壓力流量控制器OB1 MK4，結(jié)合科式流量計(jì)BFS1+和數(shù)字流量傳感器MFS2，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的兩相液體流動(dòng)。

微液滴直徑40μm（未作任何清洗的64孔板中觀察液滴小球）

測(cè)試裝置照片：

倒置顯微鏡MI52-N下的液滴小球|微流控應(yīng)用

倒置顯微鏡 MI52-N 是一款高品質(zhì)的光學(xué)顯微鏡，可用于生物、醫(yī)學(xué)、教學(xué)等領(lǐng)域。其特殊的倒置設(shè)計(jì)使得觀察細(xì)胞樣品更加方便，同時(shí)其無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)和緊湊穩(wěn)定的高剛性主體，保證了顯微鏡的可升級(jí)性和穩(wěn)定性。在液滴小球微流控應(yīng)用中，倒置顯微鏡 MI52-N 可以搭配高速相機(jī)MS16-H實(shí)現(xiàn)對(duì)液滴的實(shí)時(shí)控制和觀測(cè)。

液滴小球微流控技術(shù)是一種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，該技術(shù)利用微流控芯片和液滴操控技術(shù)，可以用極少耗材實(shí)現(xiàn)樣品的處理和控制。例如，可以使用倒置顯微鏡 MI52-N 相襯觀察技術(shù)觀測(cè)液滴的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，也可以用升級(jí)熒光觀察的MF52-N對(duì)液滴進(jìn)行熒光觀測(cè)，檢測(cè)樣品中是否存在特定的蛋白質(zhì)或分子。

同時(shí)，倒置顯微鏡 MI52-N 搭配高速相機(jī)還可以用于液滴的實(shí)時(shí)控制和觀測(cè)。例如，可以使用液滴微流控技術(shù)制備特定的液滴，并通過(guò)倒置顯微鏡 MI52-N 對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，研究液滴的運(yùn)動(dòng)和相互作用。

總之，倒置顯微鏡 MI52-N 是一種非常重要的實(shí)驗(yàn)室工具，可以用于液滴小球微流控應(yīng)用中的樣品預(yù)處理和后處理，以及液滴的實(shí)時(shí)控制和觀測(cè)。通過(guò)使用倒置顯微鏡 MI52-N可以進(jìn)行液滴小球微流控研究，推動(dòng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。

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來(lái)源：https://www.mshot.com/article/1784.html

一個(gè)簡(jiǎn)單的常規(guī)的微流體液滴小球產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由多通道壓力流量控制器OB1 MK3+，倒置光學(xué)顯微鏡和高速相機(jī)，微流體質(zhì)量流量計(jì)BFS1+和微流體流量傳感器MFS2、PDMS液滴芯片套裝及Emulseo FluoSurf HFE7500連續(xù)油相等組成。

只需要簡(jiǎn)單的三步（連接裝置，推入液體，調(diào)節(jié)流速），便可產(chǎn)生所需要的液滴小球。

如果動(dòng)手能力強(qiáng)的話，可以自行在實(shí)驗(yàn)室搭建顯微成像平臺(tái)（利用無(wú)限遠(yuǎn)平場(chǎng)物鏡、放大倍數(shù)的鏡筒和相機(jī)等的組合），也可以搭建液滴產(chǎn)生系統(tǒng)。

FluoSurf HFE7500或FC40氟化油具有生物相容性，兼容PDMS芯片，可以延長(zhǎng)PDMS芯片的使用壽命。我司備有大量的emulseo FluoSurf表面活性劑，隨時(shí)滿(mǎn)足您的應(yīng)用需要如單細(xì)胞分析、數(shù)字PCR、液滴小球包裹、細(xì)胞培養(yǎng)、化學(xué)反應(yīng)過(guò)程控制、水凝膠合成、氫膠合成等。

下圖是FluoSurf表面活性劑和微流體液滴實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)平臺(tái)的實(shí)物照片。

恭賀FluoSurf 表面活性劑獲得國(guó)際ISO 9001資格認(rèn)證。

FluoSurf表面活性劑和氟油135及7500是數(shù)字PCR，單細(xì)胞包封，蛋白質(zhì)液滴合成，液滴微流控實(shí)驗(yàn)等用的常用化學(xué)試劑。

FluoSurf表面活性劑可幫助實(shí)驗(yàn)用戶(hù)直接取得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而無(wú)需擔(dān)心活性劑的純度和重復(fù)性。

（1）立即制備微流體液滴
         打開(kāi)箱子，連接裝置，產(chǎn)生液滴。
（2）可再現(xiàn)的高單分散性
         產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)分散度＜2%的液滴
（3）適用于多種應(yīng)用實(shí)驗(yàn)
         聚合物顆粒，包裹/封裝，微乳液等等

憑借該微流控液滴套裝，您可以隨時(shí)進(jìn)行液滴產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)并獲得穩(wěn)定的高單分散性液滴。

基于Z暢銷(xiāo)的多通道OB1流量控制器，微流控液滴套裝包含了研究人員從開(kāi)箱即用的開(kāi)始產(chǎn)生液滴和乳液所需的全部組件。微流控液滴為微流控技術(shù)帶來(lái)了諸多優(yōu)勢(shì)如出色的單分散性、可重復(fù)性和可擴(kuò)展性。

特色
微流控液滴套裝使用2通道的流量控制器OB1中的一個(gè)通道泵送分散相流體，使用第二通道泵送連續(xù)相流體，從而使兩相流體進(jìn)入到微流體芯片通道內(nèi)，利用微流體芯片內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)形成油包水（W/O）或水包油（O/W）液滴。液滴尺寸由微流體芯片通道尺寸和兩相的流速比決定。借助液體流量傳感器MFS或者BFS，可以測(cè)量流體通路上的液體流量，或者利用閉環(huán)反饋功能，實(shí)現(xiàn)液體流量的恒定控制，將穩(wěn)定的兩相液體流量輸送入微流體芯片內(nèi)。

通過(guò)向微流控液滴套裝中添加額外的壓力通道和特定的微流體芯片，還可以進(jìn)行高級(jí)的液滴實(shí)驗(yàn)，例如產(chǎn)生兩種試劑的液滴、雙乳液滴、聚合物膠囊等。

為什么利用微流控技術(shù)產(chǎn)生微液滴？
微流控技術(shù)對(duì)液滴尺寸可控及可重復(fù)性的產(chǎn)生，這是任何其他技術(shù)都無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。恒定的液滴芯片結(jié)構(gòu)尺寸和液體流速可產(chǎn)生單分散性小于2%的乳液滴。

此外，微流體技術(shù)是處理超小體積并控制進(jìn)入每個(gè)液滴內(nèi)的物質(zhì)的理想技術(shù)。微流體技術(shù)可使您輕松靈活地產(chǎn)生具有相同含量的相同液滴或產(chǎn)生具有獨(dú)特有效載荷的單個(gè)液滴。

配置您的液滴產(chǎn)生套裝
1、為您的應(yīng)用選擇合適的微流體芯片
     我們提供各種尺寸、規(guī)格和材料的芯片。

2、選擇合適的儲(chǔ)液池大小
     您是在處理小樣品，還是正在研究生產(chǎn)100× mL的乳液？我們提供了與OB1流量控制器兼容的各種儲(chǔ)液池，從1.5mL的Eppendorf管到100mL的玻璃瓶。
 

3、油和表面活性劑
     為了產(chǎn)生wan美而穩(wěn)定的液滴，我們還提供了多種油和表面活性劑。

對(duì)液滴細(xì)胞生物學(xué)感興趣嗎？
您是否要進(jìn)行Drop-Seq液滴測(cè)序?qū)嶒?yàn)？細(xì)菌在液滴內(nèi)生長(zhǎng)？細(xì)胞包裹？您可以隨時(shí)聯(lián)系我們，以獲取適合您應(yīng)用需求的專(zhuān)用單細(xì)胞套裝。

微液滴應(yīng)用
（1）簡(jiǎn)單乳液滴
（2）雙乳液滴
（3）水凝膠
（4）泡沫
（5）聚合物合成
（6）API封裝
（7）藥物輸送
（8）納米粒子
（9）單細(xì)胞包裹
（10）液滴測(cè)序Drop-Seq
（11）細(xì)胞培養(yǎng)
   

包含的組件
標(biāo)準(zhǔn)微流控液滴套裝包含以下內(nèi)容：
（1）2通道的流量控制器OB1
（2）2個(gè)液體流量傳感器MFS或BFS
（3）1個(gè)微流控液滴芯片
（4）2個(gè)儲(chǔ)液池
（5）所有必需的附件：導(dǎo)管、連接器、過(guò)濾器等
（6）1小瓶液滴生成油
（7）圖形操作軟件ESI（無(wú)限制的免費(fèi)下載）
（8）用戶(hù)指南包含液滴尺寸圖，可讓您選擇合適的液體流速以獲得所需要的液滴尺寸。

可升級(jí)選項(xiàng)：
（1）額外的流量控制通道OB1
（2）額外的流量傳感器
（3）電腦
（4）顯微鏡和相機(jī)

微流體技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)可以應(yīng)用于許多的液滴應(yīng)用，因此，可以調(diào)整微流控液滴套裝里的組件以適應(yīng)您的特定需求。

相關(guān)應(yīng)用

• Researchers’opinion on droplet generation in microfluidics: syringe pumps or pressure control ? [Review]

• Generate droplets in microfluidics capillary [Application Note]

• Droplet Sequencing (Drop-Seq) [Review]

• Microfluidic flow focusing droplet generation [Application Note]

• How to perform microfluidic droplets on demand [Application Note]

• How to perform microfluidic droplets with droplet generation pack [Application Note]

• Detection of fluorescent droplets using Optoreader

參考文獻(xiàn)

High-Throughput Step Emulsification for the Production of Functional Materials Using a Glass Microfluidic Device

Macromolecular Journals, D. Weitz et al.

Controllable generation and encapsulation of alginate fibers using droplet-based microfluidics

Lab on a Chip, Nov 2015, A. J. deMello et al.

Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production

Scientific Reports, Sept 2017, G. Whyte et al.

Negative Pressure Induced Droplet Generation in a Microfluidic Flow-focusing Device 

Analytical Chemistry, Feb 2017, Say Hwa Tan et al

FluoSurf (2%, w/w) in HFE 7500 含氟表面活性劑 

Zhu B, Du Z, Dai Y, Kitguchi T, Behrens S, Seelig B. Nanodroplet-based reagent delivery into water-in-fluorinated-oil droplets. ChemRxiv. Cambridge: Cambridge Open Engage; 2023;  

體外區(qū)隔化是一種生成油包水微滴的技術(shù)，用于建立基因型(DNA信息)-表型(生物分子功能)連鎖，這是許多生物學(xué)應(yīng)用所需要的。近年來(lái)，由于氟化油具有較好的生物相容性，在微滴制造中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。然而，需要在含氟水的油微滴中添加試劑來(lái)進(jìn)行多步反應(yīng)是困難的。芯片上的微滴操作通常用于此目的，但它可能遇到一些技術(shù)問(wèn)題，即低通量或?qū)⒃噭┻f送到不同的微滴中有時(shí)間延遲。因此，我們?cè)u(píng)估了采用基于納米液滴的方法使用銅離子和中等大小的肽(2 kDa)分子來(lái)解決這些問(wèn)題的可行性。

細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，在類(lèi)型和狀態(tài)上有很大差異。在大多數(shù)生物系統(tǒng)中，我們對(duì)細(xì)胞多樣性的認(rèn)識(shí)是不完整的，就像神經(jīng)系統(tǒng)（腦細(xì)胞）這樣的復(fù)雜組織[1]。單細(xì)胞識(shí)別和功能的表征，作為對(duì)每個(gè)細(xì)胞的功能和反應(yīng)的理解，將加速生物領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)。它可能是癌癥、腫瘤，幾何任何可能在細(xì)胞群中具有多樣性的東西。然而，今天的技術(shù)并不能提供一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)同時(shí)分析大量的單個(gè)細(xì)胞。快速、可擴(kuò)展的液滴測(cè)序（Drop-Seq）這種方法可以用來(lái)表征具有許多細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)的復(fù)雜組織。

Drop-Seq的原理和好處
Drop-Seq是一種基于使用微流體技術(shù)的方法，通過(guò)將它們封裝在微小液滴中進(jìn)行平行分析，可以快速分析數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞。

這些納升級(jí)水性隔離室已用于微流體器件中的許多應(yīng)用：納米顆粒制造、乳液和泡沫、藥物輸送，但也作為PCR和逆轉(zhuǎn)錄的微小反應(yīng)室[3]。Drop-Seq使用液滴將細(xì)胞分隔成納升大小的反應(yīng)室，用于分析其mRNA轉(zhuǎn)錄物，同時(shí)使用分子條形碼策略記住轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞。通過(guò)這種技術(shù)，一個(gè)科學(xué)家每天可以制作10000個(gè)單細(xì)胞庫(kù)，實(shí)驗(yàn)并行進(jìn)行且簡(jiǎn)單。因此，該方法將允許為已知細(xì)胞類(lèi)別和新的候選細(xì)胞亞型產(chǎn)生基因表達(dá)的分子圖譜。

Drop-Seq利用微流體的優(yōu)勢(shì)

（1）很短的時(shí)間內(nèi)有很高的吞吐量

（2）盡量減少昂貴樣品的消耗

Drop-Seq包含以下步驟

1. 從組織中制備單細(xì)胞懸浮液
2. 準(zhǔn)備條形碼引物（或者在微顆粒表面或者在內(nèi)部）
3. 使用微流體裝置將每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)地與一個(gè)微小條紋的微粒共同包覆或封裝在一個(gè)微小的液滴中
4. 一旦分離成液滴，裂解細(xì)胞，釋放它們的mRNA，然后與引物（primers）雜交。
5. 打破液滴并產(chǎn)生STAMP（附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組）
6. 放大STAMP
7. 測(cè)試和分析：使用STAMP條形碼推斷每個(gè)轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞

Drop-Seq可以使用2種beads：
A：“簡(jiǎn)單”的微粒
B：水凝膠微粒

該項(xiàng)工作的ZD是“簡(jiǎn)單”微粒的使用，并簡(jiǎn)要介紹了水凝膠微粒，其原理保持不變。

Drop-Seq使用簡(jiǎn)單的微粒
1. 從復(fù)雜的組織中準(zhǔn)備單細(xì)胞懸浮液
將復(fù)雜組織解離成單個(gè)細(xì)胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每個(gè)微粒包含超過(guò)108個(gè)單獨(dú)的引物，它們共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“細(xì)胞條形碼（cell barcode）”，但具有不同的獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符（UMI）。事實(shí)上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，這允許在STAMP形成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)胞條形碼，僅在相同微粒的所有引物上相同但與其他beads上的細(xì)胞條形碼不同，允許回復(fù)細(xì)胞的起源。每種引物上不同的UMI允許對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù)并鑒定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕獲mRNA并引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄。

細(xì)胞條形碼的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
為了產(chǎn)生細(xì)胞條形碼，將微粒庫(kù)重復(fù)分成四個(gè)大小相等的寡核苷酸合成反應(yīng)，向其中加入四個(gè)DNA堿基中的一個(gè)。然后，在每個(gè)循環(huán)后將微粒合并在一起，并進(jìn)行總共12次分裂-池循環(huán)（split-pool cycles）。結(jié)果是一個(gè)微粒庫(kù)，每個(gè)微粒具有4^12（16,777,216）個(gè)可能的DNA堿基序列之一。[4]

合成獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循環(huán)完成后進(jìn)行。將所有微粒一起進(jìn)行八輪簡(jiǎn)并合成，每個(gè)循環(huán)期間可獲得所有四種DNA堿基，使得每個(gè)單獨(dú)的引物接受4^8（65,536）種可能序列（UMI）中的一種。[5]

3. 微流體裝置
一旦單細(xì)胞懸浮液和微粒準(zhǔn)備就緒，使用定制設(shè)計(jì)的微流體裝置將單個(gè)細(xì)胞與微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

該裝置在它們分成離散的液滴之前連接兩路水相。層流防止在液滴形成之前混合兩種水相輸入，一路流相包含細(xì)胞，另一路流相包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼引物beads。

微流體裝置
組件列表
（1）倒置顯微鏡
（2）壓力控制器+3流量傳感器/三個(gè)注射泵
（3）3個(gè)falcon管/3mL注射器
（4）磁力攪拌系統(tǒng)
（5）用于實(shí)驗(yàn)裝置元件連接的微流體導(dǎo)管
（6）微流體配件和連接器
（7）PDMS共流微流體液滴生成裝置
（8）用于beads的100微米細(xì)胞過(guò)濾器
（9）用于細(xì)胞的40微米細(xì)胞過(guò)濾器
（10）計(jì)數(shù)室

實(shí)驗(yàn)裝置連接示意圖

4. 細(xì)胞裂解和RNA雜交
在液滴形成后，立即將每個(gè)細(xì)胞在液滴內(nèi)裂解并釋放其mRNA。然后，它們與其伴隨的微粒表面上的引物雜交。

5. STAMPS產(chǎn)生
為了一次有效地產(chǎn)生數(shù)千個(gè)STAMP，通過(guò)添加試劑來(lái)破壞液滴以使油-水界面不穩(wěn)定，并收集和洗滌微粒。然后將mRNA在一個(gè)反應(yīng)中一起逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成一組稱(chēng)為“附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通過(guò)PCR反應(yīng)在池（pools）中擴(kuò)增條形碼化的STAMP，用于高通量mRNA測(cè)序，以分析任何所需數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞。

7. 測(cè)序和分析
使用高容量平行測(cè)序?qū)γ總€(gè)末端對(duì)得到的分子進(jìn)行測(cè)序。首先，將讀數(shù)與參考基因組比對(duì)以鑒定cDNA的起源基因。接下來(lái)，通過(guò)細(xì)胞條形碼組織讀數(shù)，并且對(duì)每個(gè)細(xì)胞中確定的每個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù)。這是UMI發(fā)揮作用的地方，避免從同一mRNA轉(zhuǎn)錄物中重復(fù)計(jì)數(shù)序列讀數(shù)。隨后，可以建立數(shù)字基因表達(dá)測(cè)量矩陣（每個(gè)細(xì)胞每個(gè)基因一個(gè)測(cè)量）用于進(jìn)一步的分析。

使用水凝膠微球的Drop-Seq測(cè)序
關(guān)于水凝膠beads的使用，操作原理或多或少與以上保持相同，即Z大的區(qū)別在于引物（primers），它們位于微粒內(nèi)而不是位于它們的表面上。

為此，微流體裝置由三個(gè)通道而不是兩個(gè)通道組成：
（1）帶beads的一個(gè)通道（Z關(guān)鍵的部分）
（2）把細(xì)胞帶入液滴的一個(gè)通道
（3）帶來(lái)我們需要進(jìn)行分析的化學(xué)試劑的一個(gè)通道

至于“簡(jiǎn)單微粒（simple microparticles）”的使用，水凝膠beads含有可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物，然后隨后對(duì)液滴內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行條形碼編碼，由此獲得作為RNA序列的拷貝的DNA序列的集合，并且現(xiàn)在通過(guò)它們來(lái)自哪一個(gè)液滴來(lái)對(duì)這些序列進(jìn)行分類(lèi)。

然后，可以打破液滴并將整個(gè)細(xì)胞群作為大量樣品處理，知道每個(gè)細(xì)胞已被單獨(dú)編碼。

相關(guān)的資源
開(kāi)源鏈接：McCarroll Lab

液滴測(cè)序：Droplet-Sequencing

參考論文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

微流控液滴技術(shù)是近年來(lái)在微流控芯片上發(fā)展起來(lái)的一種研究幾微米至幾百微米尺度范圍內(nèi)微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)。微液滴常作為微反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)生化反應(yīng)、試劑快速混合以及微顆粒合成等，極大地強(qiáng)化了微流控芯片的低消耗、自動(dòng)化和高通量等優(yōu)點(diǎn)。本次網(wǎng)絡(luò)課堂主要介紹了微流控液滴的動(dòng)態(tài)分析部分如速度場(chǎng)、表面活性劑等知識(shí)。

實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：高壓放大器在微液滴高通量液滴分選實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模夯谖⒁旱蔚膯渭?xì)胞測(cè)序通量高，交叉污染程度低，被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞分析，由于液滴在生成時(shí)液滴內(nèi)包裹細(xì)胞與微珠的情況服從雙泊松分布，為保證有效樣本純度，造成了樣本損失問(wèn)題與有效樣本比例過(guò)低的問(wèn)題。針對(duì)此問(wèn)題，本論文設(shè)計(jì)并實(shí)驗(yàn)了一種高通量液滴分選與融合的方案，旨在解決由雙泊松分布問(wèn)題造成的樣本損失。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：微流注射泵，激光器沒(méi)數(shù)據(jù)采集卡，信號(hào)發(fā)生器，ATA-2161高壓放大器，示波器，高通濾光片。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

（1）細(xì)胞分選方案設(shè)計(jì)；

如下圖所示為熒光激發(fā)液滴分選方案設(shè)計(jì)原理圖，液滴在高速通過(guò)熒光檢測(cè)的光斑位置處時(shí)，陽(yáng)性液滴被激光激發(fā)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)物鏡以及光路射入PMT陰極，經(jīng)PMT放大后傳入信號(hào)采集系統(tǒng)，觸發(fā)信號(hào)觸發(fā)信號(hào)發(fā)生器，輸出一段恒定的交流電壓，后再經(jīng)ATA-2161高壓放大器放大為高頻高壓交流電，加在電極兩端用于對(duì)液滴施加介電泳力。

液滴分選方案實(shí)驗(yàn)原理圖

（2）FADS 系統(tǒng)搭建。

主要由三部分組成:微流控芯片、光電檢測(cè)模塊、數(shù)據(jù)采集與控制系統(tǒng)模塊。

系統(tǒng)實(shí)物圖

將生成好的液滴置入注射器中，倒置使液滴全部懸浮于液面以上，設(shè)置體積流速為20μL/h將液滴從水相入口注入，取1mL油作為連續(xù)相以700μL/h體積流速?gòu)膶?duì)應(yīng)入口注入。將芯片置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，并調(diào)整位置使得激光光斑垂直照射在流道中央，最后固定芯片位置，持續(xù)注射液滴，觀察Labview前面板上的熒光檢測(cè)信號(hào)與高速攝像機(jī)拍攝畫(huà)面，調(diào)節(jié)高壓放大器放大倍數(shù)，使得液滴在不破裂的情況下能夠被完整地拉入陽(yáng)性流道。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

在正常狀態(tài)下，液滴在油加速后高速流過(guò)流道，沒(méi)有包裹熒光微球的液滴沒(méi)有激活電極，所以在流場(chǎng)曳力作用下流入較寬的默認(rèn)流道;如圖b所示，當(dāng)包裹著16微米熒光微球的液滴經(jīng)過(guò)光斑檢測(cè)區(qū)域時(shí)，微球被激發(fā)發(fā)出熒光，被高速攝像機(jī)與PMT捕捉，而后通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)與控制系統(tǒng)激活電極，電極給與液滴-一個(gè)正介電泳力，將液滴拉入較為窄的分選流道，如圖c中被拉入分選流道的液滴即為圖b中的發(fā)光液滴。以此完成液滴高通量分選。

通過(guò)分選包裹著488nm熒光微球的液滴，從理論_上實(shí)現(xiàn)了基于介電泳的熒光激發(fā)液滴分選，且準(zhǔn)確率較高。

實(shí)驗(yàn)中用到的高壓放大器ATA-2161主要指標(biāo)：

本文實(shí)驗(yàn)素材由西安安泰整理發(fā)布，安泰高壓放大器廣泛應(yīng)用于壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)、超聲波測(cè)試、聲吶系統(tǒng)應(yīng)用和MEMS測(cè)試等，如果想了解高壓放大器更多應(yīng)用，歡迎訪問(wèn)安泰測(cè)試網(wǎng)。

導(dǎo)讀

盡管各國(guó)衛(wèi)生系統(tǒng)發(fā)展迅速，但由病原菌引起的傳染病仍然是人類(lèi)健康的主要威脅之一。據(jù)報(bào)道，全世界每年有220多萬(wàn)人死于水傳播大腸桿菌病原體。盡管大多數(shù)大腸菌群是無(wú)害的，但某些大腸桿菌的存在可能會(huì)導(dǎo)致甚至威脅到人類(lèi)健康，例如，大腸桿菌O157:H7和其他產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常見(jiàn)因素，可能對(duì)健康造成嚴(yán)重后果，尤其是對(duì)幼兒。因此，檢測(cè)大腸桿菌對(duì)于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及食品、水和空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)非常重要。

大連理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，工業(yè)生態(tài)學(xué)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家，開(kāi)發(fā)出基于naica?全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單細(xì)菌檢測(cè)方法，該方法可以在1.5小時(shí)內(nèi)以單細(xì)胞靈敏度選擇性檢測(cè)臨床尿液樣本中的大腸桿菌 。該方法發(fā)表在《Analytical Methods》，題為“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  dDRCA系統(tǒng)，能夠快速、選擇性地檢測(cè)具有單細(xì)胞敏感性的大腸桿菌 ，dDRCA系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度比之前報(bào)道的PAD高1000倍。

? 證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染診斷中的潛在臨床適用性，dDRCA能夠在不到1.5小時(shí)內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識(shí)別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時(shí)。

文中采用naica??全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)液滴微流控技術(shù)，快速精準(zhǔn)的檢測(cè)到復(fù)雜樣本和高背景樣本中的致病大腸桿菌。

通常擴(kuò)增需要約4小時(shí)進(jìn)行定量大腸桿菌檢測(cè)。在這項(xiàng)研究中，我們描述了DNA酶偶聯(lián)滾圈擴(kuò)增（RCA），這是一種高效的等溫酶DNA復(fù)制過(guò)程，可在naica??全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，以建立液滴DNA酶偶聯(lián)RCA（表示為dDRCA）系統(tǒng)。我們進(jìn)一步證明，該系統(tǒng)能夠在1.5小時(shí)內(nèi)以單細(xì)胞敏感性選擇性檢測(cè)臨床尿液樣本中的大腸桿菌。

▲圖2（a）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析RCA產(chǎn)物（RP）。（b） 反應(yīng)混合物在指示反應(yīng)條件下的熒光響應(yīng)：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line);  RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line);  RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line); + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3閱讀器圖像（左）、CLSM圖像（中）和熒光顯微鏡圖像（右）為微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反應(yīng)條件下dDRCA系統(tǒng)的熒光圖像和熒光滴數(shù)：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli;（e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli; (f) -RFD-EC1/+ RDS/  E. coli; (g) + RFD-EC1/+ RDS/  E. coli.

使用Naica Prism3閱讀器對(duì)生成的熒光液滴進(jìn)行成像和分析。dDRCA系統(tǒng)能夠在75分鐘內(nèi)選擇性計(jì)數(shù)具有單細(xì)胞敏感性的大腸桿菌，包括20分鐘的細(xì)胞裂解時(shí)間、12分鐘的液滴生成時(shí)間和43分鐘的液滴反應(yīng)時(shí)間。

通過(guò)比較其他三種常見(jiàn)細(xì)菌，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli）存在時(shí)的信號(hào)反應(yīng)，也檢查了dDRCA檢測(cè)大腸桿菌的選擇性。當(dāng)用緩沖液或尿液中的這些意外靶點(diǎn)測(cè)試每個(gè)dDRCA系統(tǒng)時(shí)，未觀察到明顯的熒光液滴（圖4c和S4?）。

▲圖4（a）不同大腸桿菌濃度（每毫升細(xì)胞數(shù)）下dDRCA反應(yīng)的熒光圖像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同濃度下計(jì)數(shù)的液滴數(shù)與大腸桿菌之間的關(guān)系。提供了計(jì)數(shù)的液滴數(shù)量，插圖顯示了1–104大腸桿菌范圍內(nèi)的線性反應(yīng)。誤差條代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。（c） dDRCA的特異性。

最終證明了dDRCA系統(tǒng)在尿路感染（UTI）診斷中的潛在臨床適用性。分析了20份患者和健康獻(xiàn)血者的臨床尿樣。整個(gè)操作程序包括：（1）細(xì)胞收集和裂解（25分鐘）；（2） 液滴生成（12分鐘）；（3） 液滴反應(yīng)（43分鐘）。如圖5c所示，五個(gè)尿樣，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿樣產(chǎn)生大量熒光液滴（>3000）。使用傳統(tǒng)的大腸桿菌培養(yǎng)方法進(jìn)一步確認(rèn)了這些有無(wú)大腸桿菌感染的樣本（圖5d）。因此，對(duì)UTI的診斷有很大的希望。

▲圖5（a）檢測(cè)尿液樣本中的大腸桿菌。（b） 顯示尿液樣本中計(jì)數(shù)數(shù)與大腸桿菌細(xì)胞在1-104范圍內(nèi)的線性相關(guān)性的曲線圖。（c） 20份臨床尿液樣本中陽(yáng)性液滴的數(shù)量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖電解質(zhì)缺乏）瓊脂細(xì)菌尿液培養(yǎng)板。黃色菌落代表大腸桿菌在37℃的CLED瓊脂中培養(yǎng)22小時(shí)后的生長(zhǎng)。

該系統(tǒng)能夠在不到1.5小時(shí)的分析時(shí)間內(nèi)，從20份臨床尿液樣本中成功識(shí)別出5名UTI患者，而傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要數(shù)小時(shí)。

naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。

導(dǎo)讀

除了在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外，tRNA可以被切割成較短的生物活性片段，稱(chēng)為tRNA片段（tRFs）。來(lái)自精細(xì)胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代謝紊亂。因此，種系細(xì)胞中的tRFs是表觀遺傳的一種機(jī)制，然而壓力和毒素會(huì)導(dǎo)致tRFs模式的改變。華盛頓大學(xué)婦產(chǎn)科臨床研究部的研究人員在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上發(fā)表題為《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究對(duì)注射類(lèi)藥物（一個(gè)重要的壓力源）是否會(huì)影響生殖細(xì)胞中的tRFs感興趣。研究者對(duì)來(lái)自注射阿pian類(lèi)藥物病人(PWID)和非藥物使用對(duì)照組精液來(lái)源外泌體及精母細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序。測(cè)序后采用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，該技術(shù)的應(yīng)用為藥物濫用相關(guān)生育問(wèn)題的研究提供了新的策略和方法。

阿pian藥物濫用對(duì)生殖系統(tǒng)的影響一直備受關(guān)注。近期一項(xiàng)研究揭示了注射阿pian類(lèi)藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體的變化。該研究通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)tRNA-Gly-GCC外泌體，發(fā)現(xiàn)未注射阿pian類(lèi)藥物的男性與注射阿pian類(lèi)藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體存在顯著差異。

tRNA-Gly-GCC外泌體在精子發(fā)生和成熟過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。研究結(jié)果表明，這些差異可能與精子質(zhì)量和生育能力的下降有關(guān)。naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)在本研究中的應(yīng)用，不僅提供了高靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測(cè)方法，對(duì)揭示阿pian類(lèi)藥物對(duì)生殖系統(tǒng)的影響具有重要意義。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

?  naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)可以在RNA濃度低于檢測(cè)下限的樣品中檢測(cè)兩種tRFs形式。

? naica^?微滴芯片數(shù)字PCR結(jié)果與RNA測(cè)序結(jié)果具有很好的相關(guān)性，但比測(cè)序具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，有助于深入了解長(zhǎng)期使用阿pian類(lèi)藥物的生物學(xué)影響。

研究結(jié)果：

▲圖１.男性長(zhǎng)期使用阿pian類(lèi)藥物導(dǎo)致精子中tRF-Gly亞型比例的變化,使用naica^?微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)定量tRFs。成熟精子細(xì)胞通過(guò)45-90% Percoll梯度純化，并使用核苷素試劑盒分離小RNA。cDNA使用一種特定的莖環(huán)RT引物與“長(zhǎng)”tsRNA亞型（53個(gè)核苷酸長(zhǎng)）或另一種靶向“短”tsRNA變體（32個(gè)核苷酸長(zhǎng)）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“長(zhǎng)”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（C）“長(zhǎng)”與“短”tRF Gly-GCC亞型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的濃度?！癈”：對(duì)照組（不注射藥品的男性）;“PWID”：阿pian藥物注射組。P值通過(guò)單尾曼-惠特尼U檢驗(yàn)計(jì)算。對(duì)照組：n=10，PWID組：n=13。

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中超過(guò)90%的reads到較短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的讀數(shù)。相比之下，對(duì)照組中只有4.1%的reads到更長(zhǎng)的tRF，而PWID為45.6%。PWID的長(zhǎng)/短tRF比顯著高于對(duì)照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)精液來(lái)源的外泌體中小核仁RNA（snoRNA）表達(dá)差異。盡管無(wú)法確立PWID的發(fā)現(xiàn)與阿pian類(lèi)藥物使用之間的直接聯(lián)系，但研究表明阿pian類(lèi)藥物注射和/或相關(guān)多藥使用習(xí)慣和生活方式改變可能會(huì)影響表觀遺傳。這為阿pian類(lèi)藥物使用的可遺傳影響提供了證據(jù)，并為進(jìn)一步研究其跨代健康影響的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

數(shù)字PCR技術(shù)在研究PWID中差異表達(dá)的tRFs方面發(fā)揮了重要作用。由于精液中含有復(fù)雜的細(xì)胞混合物，意味著其中含有抑制劑，對(duì)于PCR的擴(kuò)增有很大影響。但數(shù)字PCR有抗抑制劑干擾的特點(diǎn)，所以對(duì)于這類(lèi)復(fù)雜樣本的檢測(cè)更為適用。文章中數(shù)字PCR和測(cè)序各自發(fā)揮了作用：測(cè)序用于發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)tRF和短tRF，而數(shù)字PCR則準(zhǔn)確檢測(cè)了tRF片段的表達(dá)差異，進(jìn)而驗(yàn)證了測(cè)序的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)表明，數(shù)字PCR在研究tRFs和其他非編碼RNA片段方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。數(shù)字PCR不僅可以在tRFs和其他類(lèi)似的研究中提供更為精確的結(jié)果，還可以在諸如癌癥、遺傳學(xué)和傳染病等領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。

naica^?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^?六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的juedui拷貝數(shù)濃度。

微流控液滴技術(shù)是近年來(lái)在微流控芯片上發(fā)展起來(lái)的一種研究幾微米至幾百微米尺度范圍內(nèi)微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)。微液滴常作為微反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)生化反應(yīng)、試劑快速混合以及微顆粒合成等，極大地強(qiáng)化了微流控芯片的低消耗、自動(dòng)化和高通量等優(yōu)點(diǎn)。本次網(wǎng)絡(luò)課堂主要介紹了液滴微流控的發(fā)展歷程、微液滴產(chǎn)生方式、液滴微流控的應(yīng)用領(lǐng)域、液滴產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)裝置、雙乳液滴產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)等知識(shí)。