微流控液滴技術(shù)是近年來在微流控芯片上發(fā)展起來的一種研究幾微米至幾百微米尺度范圍內(nèi)微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)。微液滴常作為微反應(yīng)器，實現(xiàn)生化反應(yīng)、試劑快速混合以及微顆粒合成等，極大地強(qiáng)化了微流控芯片的低消耗、自動化和高通量等優(yōu)點(diǎn)。本次網(wǎng)絡(luò)課堂主要介紹了微流控液滴的動態(tài)分析部分如速度場、表面活性劑等知識。

細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，在類型和狀態(tài)上有很大差異。在大多數(shù)生物系統(tǒng)中，我們對細(xì)胞多樣性的認(rèn)識是不完整的，就像神經(jīng)系統(tǒng)（腦細(xì)胞）這樣的復(fù)雜組織[1]。單細(xì)胞識別和功能的表征，作為對每個細(xì)胞的功能和反應(yīng)的理解，將加速生物領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)。它可能是癌癥、腫瘤，幾何任何可能在細(xì)胞群中具有多樣性的東西。然而，今天的技術(shù)并不能提供一種簡單的方法來同時分析大量的單個細(xì)胞?？焖?、可擴(kuò)展的液滴測序（Drop-Seq）這種方法可以用來表征具有許多細(xì)胞類型和狀態(tài)的復(fù)雜組織。

Drop-Seq的原理和好處
Drop-Seq是一種基于使用微流體技術(shù)的方法，通過將它們封裝在微小液滴中進(jìn)行平行分析，可以快速分析數(shù)千個單個細(xì)胞。

這些納升級水性隔離室已用于微流體器件中的許多應(yīng)用：納米顆粒制造、乳液和泡沫、藥物輸送，但也作為PCR和逆轉(zhuǎn)錄的微小反應(yīng)室[3]。Drop-Seq使用液滴將細(xì)胞分隔成納升大小的反應(yīng)室，用于分析其mRNA轉(zhuǎn)錄物，同時使用分子條形碼策略記住轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞。通過這種技術(shù)，一個科學(xué)家每天可以制作10000個單細(xì)胞庫，實驗并行進(jìn)行且簡單。因此，該方法將允許為已知細(xì)胞類別和新的候選細(xì)胞亞型產(chǎn)生基因表達(dá)的分子圖譜。

Drop-Seq利用微流體的優(yōu)勢

（1）很短的時間內(nèi)有很高的吞吐量

（2）盡量減少昂貴樣品的消耗

Drop-Seq包含以下步驟

1. 從組織中制備單細(xì)胞懸浮液
2. 準(zhǔn)備條形碼引物（或者在微顆粒表面或者在內(nèi)部）
3. 使用微流體裝置將每個細(xì)胞單獨(dú)地與一個微小條紋的微粒共同包覆或封裝在一個微小的液滴中
4. 一旦分離成液滴，裂解細(xì)胞，釋放它們的mRNA，然后與引物（primers）雜交。
5. 打破液滴并產(chǎn)生STAMP（附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組）
6. 放大STAMP
7. 測試和分析：使用STAMP條形碼推斷每個轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞

Drop-Seq可以使用2種beads：
A：“簡單”的微粒
B：水凝膠微粒

該項工作的ZD是“簡單”微粒的使用，并簡要介紹了水凝膠微粒，其原理保持不變。

Drop-Seq使用簡單的微粒
1. 從復(fù)雜的組織中準(zhǔn)備單細(xì)胞懸浮液
將復(fù)雜組織解離成單個細(xì)胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每個微粒包含超過108個單獨(dú)的引物，它們共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“細(xì)胞條形碼（cell barcode）”，但具有不同的獨(dú)特分子標(biāo)識符（UMI）。事實上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，這允許在STAMP形成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)胞條形碼，僅在相同微粒的所有引物上相同但與其他beads上的細(xì)胞條形碼不同，允許回復(fù)細(xì)胞的起源。每種引物上不同的UMI允許對mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行數(shù)字計數(shù)并鑒定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕獲mRNA并引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄。

細(xì)胞條形碼的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
為了產(chǎn)生細(xì)胞條形碼，將微粒庫重復(fù)分成四個大小相等的寡核苷酸合成反應(yīng)，向其中加入四個DNA堿基中的一個。然后，在每個循環(huán)后將微粒合并在一起，并進(jìn)行總共12次分裂-池循環(huán)（split-pool cycles）。結(jié)果是一個微粒庫，每個微粒具有4^12（16,777,216）個可能的DNA堿基序列之一。[4]

合成獨(dú)特的分子標(biāo)識符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循環(huán)完成后進(jìn)行。將所有微粒一起進(jìn)行八輪簡并合成，每個循環(huán)期間可獲得所有四種DNA堿基，使得每個單獨(dú)的引物接受4^8（65,536）種可能序列（UMI）中的一種。[5]

3. 微流體裝置
一旦單細(xì)胞懸浮液和微粒準(zhǔn)備就緒，使用定制設(shè)計的微流體裝置將單個細(xì)胞與微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

該裝置在它們分成離散的液滴之前連接兩路水相。層流防止在液滴形成之前混合兩種水相輸入，一路流相包含細(xì)胞，另一路流相包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼引物beads。

微流體裝置
組件列表
（1）倒置顯微鏡
（2）壓力控制器+3流量傳感器/三個注射泵
（3）3個falcon管/3mL注射器
（4）磁力攪拌系統(tǒng)
（5）用于實驗裝置元件連接的微流體導(dǎo)管
（6）微流體配件和連接器
（7）PDMS共流微流體液滴生成裝置
（8）用于beads的100微米細(xì)胞過濾器
（9）用于細(xì)胞的40微米細(xì)胞過濾器
（10）計數(shù)室

實驗裝置連接示意圖

4. 細(xì)胞裂解和RNA雜交
在液滴形成后，立即將每個細(xì)胞在液滴內(nèi)裂解并釋放其mRNA。然后，它們與其伴隨的微粒表面上的引物雜交。

5. STAMPS產(chǎn)生
為了一次有效地產(chǎn)生數(shù)千個STAMP，通過添加試劑來破壞液滴以使油-水界面不穩(wěn)定，并收集和洗滌微粒。然后將mRNA在一個反應(yīng)中一起逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成一組稱為“附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通過PCR反應(yīng)在池（pools）中擴(kuò)增條形碼化的STAMP，用于高通量mRNA測序，以分析任何所需數(shù)量的單個細(xì)胞。

7. 測序和分析
使用高容量平行測序?qū)γ總€末端對得到的分子進(jìn)行測序。首先，將讀數(shù)與參考基因組比對以鑒定cDNA的起源基因。接下來，通過細(xì)胞條形碼組織讀數(shù)，并且對每個細(xì)胞中確定的每個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量進(jìn)行數(shù)字計數(shù)。這是UMI發(fā)揮作用的地方，避免從同一mRNA轉(zhuǎn)錄物中重復(fù)計數(shù)序列讀數(shù)。隨后，可以建立數(shù)字基因表達(dá)測量矩陣（每個細(xì)胞每個基因一個測量）用于進(jìn)一步的分析。

使用水凝膠微球的Drop-Seq測序
關(guān)于水凝膠beads的使用，操作原理或多或少與以上保持相同，即Z大的區(qū)別在于引物（primers），它們位于微粒內(nèi)而不是位于它們的表面上。

為此，微流體裝置由三個通道而不是兩個通道組成：
（1）帶beads的一個通道（Z關(guān)鍵的部分）
（2）把細(xì)胞帶入液滴的一個通道
（3）帶來我們需要進(jìn)行分析的化學(xué)試劑的一個通道

至于“簡單微粒（simple microparticles）”的使用，水凝膠beads含有可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物，然后隨后對液滴內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行條形碼編碼，由此獲得作為RNA序列的拷貝的DNA序列的集合，并且現(xiàn)在通過它們來自哪一個液滴來對這些序列進(jìn)行分類。

然后，可以打破液滴并將整個細(xì)胞群作為大量樣品處理，知道每個細(xì)胞已被單獨(dú)編碼。

相關(guān)的資源
開源鏈接：McCarroll Lab

液滴測序：Droplet-Sequencing

參考論文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

微流控液滴技術(shù)是近年來在微流控芯片上發(fā)展起來的一種研究幾微米至幾百微米尺度范圍內(nèi)微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)。微液滴常作為微反應(yīng)器，實現(xiàn)生化反應(yīng)、試劑快速混合以及微顆粒合成等，極大地強(qiáng)化了微流控芯片的低消耗、自動化和高通量等優(yōu)點(diǎn)?；谝旱蔚奈⒘骺丶夹g(shù)可應(yīng)用于單孢子或細(xì)菌類的包裹實驗應(yīng)用。本次網(wǎng)絡(luò)課堂主要介紹了單孢子包裹/封裝液滴用于致病真菌的研究。

應(yīng)用領(lǐng)域：農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)、殺菌劑的發(fā)現(xiàn)與設(shè)計、殺菌劑篩選、殺菌劑的抗性和敏感性及分子-植物相互作用等

（1）立即制備微流體液滴
         打開箱子，連接裝置，產(chǎn)生液滴。
（2）可再現(xiàn)的高單分散性
         產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)分散度＜2%的液滴
（3）適用于多種應(yīng)用實驗
         聚合物顆粒，包裹/封裝，微乳液等等

憑借該微流控液滴套裝，您可以隨時進(jìn)行液滴產(chǎn)生實驗并獲得穩(wěn)定的高單分散性液滴。

基于Z暢銷的多通道OB1流量控制器，微流控液滴套裝包含了研究人員從開箱即用的開始產(chǎn)生液滴和乳液所需的全部組件。微流控液滴為微流控技術(shù)帶來了諸多優(yōu)勢如出色的單分散性、可重復(fù)性和可擴(kuò)展性。

特色
微流控液滴套裝使用2通道的流量控制器OB1中的一個通道泵送分散相流體，使用第二通道泵送連續(xù)相流體，從而使兩相流體進(jìn)入到微流體芯片通道內(nèi)，利用微流體芯片內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)形成油包水（W/O）或水包油（O/W）液滴。液滴尺寸由微流體芯片通道尺寸和兩相的流速比決定。借助液體流量傳感器MFS或者BFS，可以測量流體通路上的液體流量，或者利用閉環(huán)反饋功能，實現(xiàn)液體流量的恒定控制，將穩(wěn)定的兩相液體流量輸送入微流體芯片內(nèi)。

通過向微流控液滴套裝中添加額外的壓力通道和特定的微流體芯片，還可以進(jìn)行高級的液滴實驗，例如產(chǎn)生兩種試劑的液滴、雙乳液滴、聚合物膠囊等。

為什么利用微流控技術(shù)產(chǎn)生微液滴？
微流控技術(shù)對液滴尺寸可控及可重復(fù)性的產(chǎn)生，這是任何其他技術(shù)都無法實現(xiàn)的。恒定的液滴芯片結(jié)構(gòu)尺寸和液體流速可產(chǎn)生單分散性小于2%的乳液滴。

此外，微流體技術(shù)是處理超小體積并控制進(jìn)入每個液滴內(nèi)的物質(zhì)的理想技術(shù)。微流體技術(shù)可使您輕松靈活地產(chǎn)生具有相同含量的相同液滴或產(chǎn)生具有獨(dú)特有效載荷的單個液滴。

配置您的液滴產(chǎn)生套裝
1、為您的應(yīng)用選擇合適的微流體芯片
     我們提供各種尺寸、規(guī)格和材料的芯片。

2、選擇合適的儲液池大小
     您是在處理小樣品，還是正在研究生產(chǎn)100× mL的乳液？我們提供了與OB1流量控制器兼容的各種儲液池，從1.5mL的Eppendorf管到100mL的玻璃瓶。
 

3、油和表面活性劑
     為了產(chǎn)生wan美而穩(wěn)定的液滴，我們還提供了多種油和表面活性劑。

對液滴細(xì)胞生物學(xué)感興趣嗎？
您是否要進(jìn)行Drop-Seq液滴測序?qū)嶒灒考?xì)菌在液滴內(nèi)生長？細(xì)胞包裹？您可以隨時聯(lián)系我們，以獲取適合您應(yīng)用需求的專用單細(xì)胞套裝。

微液滴應(yīng)用
（1）簡單乳液滴
（2）雙乳液滴
（3）水凝膠
（4）泡沫
（5）聚合物合成
（6）API封裝
（7）藥物輸送
（8）納米粒子
（9）單細(xì)胞包裹
（10）液滴測序Drop-Seq
（11）細(xì)胞培養(yǎng)
   

包含的組件
標(biāo)準(zhǔn)微流控液滴套裝包含以下內(nèi)容：
（1）2通道的流量控制器OB1
（2）2個液體流量傳感器MFS或BFS
（3）1個微流控液滴芯片
（4）2個儲液池
（5）所有必需的附件：導(dǎo)管、連接器、過濾器等
（6）1小瓶液滴生成油
（7）圖形操作軟件ESI（無限制的免費(fèi)下載）
（8）用戶指南包含液滴尺寸圖，可讓您選擇合適的液體流速以獲得所需要的液滴尺寸。

可升級選項：
（1）額外的流量控制通道OB1
（2）額外的流量傳感器
（3）電腦
（4）顯微鏡和相機(jī)

微流體技術(shù)的主要優(yōu)勢可以應(yīng)用于許多的液滴應(yīng)用，因此，可以調(diào)整微流控液滴套裝里的組件以適應(yīng)您的特定需求。

相關(guān)應(yīng)用

• Researchers’opinion on droplet generation in microfluidics: syringe pumps or pressure control ? [Review]

• Generate droplets in microfluidics capillary [Application Note]

• Droplet Sequencing (Drop-Seq) [Review]

• Microfluidic flow focusing droplet generation [Application Note]

• How to perform microfluidic droplets on demand [Application Note]

• How to perform microfluidic droplets with droplet generation pack [Application Note]

• Detection of fluorescent droplets using Optoreader

參考文獻(xiàn)

High-Throughput Step Emulsification for the Production of Functional Materials Using a Glass Microfluidic Device

Macromolecular Journals, D. Weitz et al.

Controllable generation and encapsulation of alginate fibers using droplet-based microfluidics

Lab on a Chip, Nov 2015, A. J. deMello et al.

Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production

Scientific Reports, Sept 2017, G. Whyte et al.

Negative Pressure Induced Droplet Generation in a Microfluidic Flow-focusing Device 

Analytical Chemistry, Feb 2017, Say Hwa Tan et al

2% surfactants表面活性劑FluoSurf
In the droplet generation unit, highly monodisperse droplets encapsulating H. lacustris cells are generated on demand. The buffer with suspended H. lacustris cells and biocompatible fluorescence oil (HFE-7500) with 2% surfactants (FluoSurf, Emulseo) are employed as the dispersed phase and the continuous phase, respectively.

用于片上生物工廠的基于液滴微流控的集成分散相顯微鏡
在代謝工程中，對單細(xì)胞胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的生物分子成像以及隨后的細(xì)胞篩選有很高的要求，以開發(fā)具有所需表型的菌株。 然而，當(dāng)前方法的能力僅限于群體規(guī)模的細(xì)胞表型鑒定。 為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，我們建議利用分散相顯微鏡與基于液滴的微流體系統(tǒng)相結(jié)合，該系統(tǒng)結(jié)合了液滴按需生成、生物分子成像和液滴按需分選，以實現(xiàn)細(xì)胞的高通量篩選 已識別的表型。 特別是，細(xì)胞被封裝在形成微流體液滴的均質(zhì)環(huán)境中，并且可以研究生物分子誘導(dǎo)的分散相以指示單個細(xì)胞中特定代謝物的生物量。 因此，檢索到的生物量信息引導(dǎo)片上液滴分選單元篩選具有所需表型的細(xì)胞。 為了證明概念，我們通過促進(jìn)湖紅球藻菌株向高產(chǎn)天然抗氧化劑蝦青素的進(jìn)化來展示該方法。 所提出的系統(tǒng)具有片上單細(xì)胞成像和液滴操作功能的驗證揭示了高通量單細(xì)胞表型分析和選擇潛力，適用于許多其他生物工廠場景，例如生物燃料生產(chǎn)、細(xì)胞治療中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性控制等。

本內(nèi)容節(jié)選自下面文獻(xiàn)：

Yingdong Luo, Yuanyuan Huang, Yani Li, Xiudong Duan, Yongguang Jiang, Cong Wang,  Jiakun Fang,* Lei Xi,*  Nam-Trung Nguyen  and  Chaolong Song, Dispersive phase microscopy incorporated with droplet-based microfluidics for biofactory-on-a-chip, Lab Chip, 2023,23, 2766-2777. DOI: 10.1039/D3LC00127J

微流控液滴技術(shù)是近年來在微流控芯片上發(fā)展起來的一種研究幾微米至幾百微米尺度范圍內(nèi)微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)。微液滴常作為微反應(yīng)器，實現(xiàn)生化反應(yīng)、試劑快速混合以及微顆粒合成等，極大地強(qiáng)化了微流控芯片的低消耗、自動化和高通量等優(yōu)點(diǎn)。本次網(wǎng)絡(luò)課堂主要介紹了液滴微流控的發(fā)展歷程、微液滴產(chǎn)生方式、液滴微流控的應(yīng)用領(lǐng)域、液滴產(chǎn)生的實驗裝置、雙乳液滴產(chǎn)生實驗等知識。

FluoSurf (2%, w/w) in HFE 7500 含氟表面活性劑 

Zhu B, Du Z, Dai Y, Kitguchi T, Behrens S, Seelig B. Nanodroplet-based reagent delivery into water-in-fluorinated-oil droplets. ChemRxiv. Cambridge: Cambridge Open Engage; 2023;  

體外區(qū)隔化是一種生成油包水微滴的技術(shù)，用于建立基因型(DNA信息)-表型(生物分子功能)連鎖，這是許多生物學(xué)應(yīng)用所需要的。近年來，由于氟化油具有較好的生物相容性，在微滴制造中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。然而，需要在含氟水的油微滴中添加試劑來進(jìn)行多步反應(yīng)是困難的。芯片上的微滴操作通常用于此目的，但它可能遇到一些技術(shù)問題，即低通量或?qū)⒃噭┻f送到不同的微滴中有時間延遲。因此，我們評估了采用基于納米液滴的方法使用銅離子和中等大小的肽(2 kDa)分子來解決這些問題的可行性。