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  如歌452 2017-02-21 00:00:00

  細(xì)胞爬片后觀察是不是要在干凈的六孔板 1. 爬片： 24*24蓋玻片，剛好用于6孔板。也可用更大的蓋玻片，放在大的培養(yǎng)皿中爬片。 2. 蓋玻片泡酸過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三 蒸水沖洗3遍（個人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不 好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒、烤干。 3．蓋玻片浸泡75%乙醇10分鐘消毒，然后酒精燈上烤干，直接放入培養(yǎng)皿，開始種細(xì)胞。ZD是玻片是干凈的、無菌的。 4.蓋玻片在液體中經(jīng)常有貼壁吸附力，用一般鑷子很難一次性夾起，將注射器針頭針尖 向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以。 【細(xì)胞爬片】 1. 胰酶消化細(xì)胞后計數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。 2. 加細(xì)胞時，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使 玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個過程注意無菌操作。 3. 根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可 4. 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計，作用一定時間后取玻片。注意細(xì)胞不能太密，否則容易掉片。 【細(xì)胞爬片的固定】 1. 細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍。但比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因?yàn)榈蛲龅?細(xì)胞在洗的過程中有可能會脫落。 2.常用的固定液 1.） 冷丙酮，可用于一般的免疫組化染色。將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。 2.）多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存 3.） 95％乙醇，可用于免疫組化。 優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。 缺點(diǎn)：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度室溫固定 15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存 4.）甲醛()應(yīng)用Z廣 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)， 缺點(diǎn)：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格 結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存。

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